大黄鱼白细胞介素7的功能及其信号通路研究

Interleukin 7 (IL-7) plays important roles in regulating lymphocyte homeostasis, proliferation, and differentiation. However, currently little is known about the function and signaling pathway of fish IL-7. In preliminary study, gene clone and expression analysis of the large yellow croaker (Larimichthys crocea) IL-7 (LycIL-7) were performed. Recombinant LycIL-7 protein was also expressed and purified in Escherichia coli. In this research, the inhibitory effect of LycIL-7 on lymphocytic apoptosis will be investigated, revealing the function of LycIL-7 on promoting lymphocytes survival. EdU, monoclonal antibodies, and flow cytometry will be used to detected the proliferation of T cells and B cells after LycIL-7 overexpression. Moreover, the effect of LycIL-7 on differentiation of Th1, Th2, and Treg cells will also be investigated. These results will reveal the function of LycIL-7 on lymphocyte proliferation and T cell differentiation. On the other hand, specific receptors and adaptor molecules of LycIL-7 will be identified by using yeast two-hybird and co-immunoprecipitation, to indicate the signaling pathways that are activated by LycIL-7. These results will not only help to reveal the function and mechanism of fish IL-7, but also push forward the application of LycIL-7 as immune adjuvant in the disease prevention of large yellow croaker.

哺乳类白细胞介素7（IL-7）主要功能是维持淋巴细胞内稳态，调节淋巴细胞生存、增殖和成熟。但目前对于鱼类IL-7的功能及信号通路知之甚少。我们前期克隆并重组表达了大黄鱼IL-7，研究了其表达模式。本项目拟在此基础上进一步研究大黄鱼IL-7对外周血淋巴细胞凋亡的抑制作用，明确大黄鱼IL-7在维持淋巴细胞生存中的功能；利用胸腺嘧啶核苷类似物EdU示踪，单克隆抗体标记结合流式细胞分析研究大黄鱼IL-7活体过表达对T和B淋巴细胞增殖的影响，以及大黄鱼IL-7在Th1、Th2和Treg细胞分化中的作用，以揭示大黄鱼IL-7在淋巴细胞增殖及T淋巴细胞分化中的功能；利用酵母双杂交和免疫共沉淀鉴定大黄鱼IL-7的受体和下游接头分子，明确大黄鱼IL-7激活的信号通路。研究结果对于认识鱼类IL-7在调节淋巴细胞生存、增殖及分化中的功能及其机制具有重要理论意义，也为将其作为免疫佐剂应用于大黄鱼病害防治提供依据。

本项目完成了大黄鱼（Larimichthys crocea）白细胞介素7（LcIL-7）分子特征与功能研究，发现LcIL-7基因在健康大黄鱼各组织或器官中呈组成型表达，在血液中表达量最低，在脾脏和鳃中表达量较高；溶藻弧菌刺激大黄鱼后，大黄鱼脾脏和头肾组织中LcIL-7基因的转录水平显著上调，说明LcIL-7可能参与大黄鱼抗细菌免疫应答。利用大肠杆菌系统重组表达了大黄鱼IL-7蛋白（rLcIL-7），体外实验发现，rLcIL7蛋白显著抑制大黄鱼外周血淋巴细胞凋亡，诱导淋巴细胞中抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1表达水平上调，并抑制促凋亡基因Bax和凋亡蛋白酶Caspase 9的转录。此外，rLcIL-7蛋白显著降低淋巴细胞中Caspase 9酶的活性，表明大黄鱼IL-7在维持大黄鱼淋巴细胞生存中发挥重要作用。腹腔注射大黄鱼rLcIL-7蛋白后，发现脾脏淋巴细胞中Th1细胞相关细胞因子和转录因子（IFN-γ、IL-2和T-bet）的表达水平显著上调，而Th2细胞相关细胞因子和转录因子（IL-4/13A和GATA3）的转录水平明显降低。表明大黄鱼IL-7可诱导Th细胞向Th1细胞分化和抑制Th细胞向Th2细胞分化。此外，对Treg细胞的发育有一定影响。免疫共沉淀表明LcIL-7特异性地与其受体中IL-7Rα亚基的胞外段结合，后者与γC胞外段组成IL-7R异源二聚体。IL-7Rα与γC胞内段分别与Jak1和Jak3相互作用，向细胞内传递IL-7信号。表明大黄鱼IL-7与受体结合后激活JAK-STAT信号通路。这些结果不仅对于深刻认识鱼类IL-7 在调节淋巴细胞生存、增殖及分化中的功能及其机制具有重要理论意义，也为将其作为免疫佐剂应用于大黄鱼病害防治提供科学依据。