基于全基因组关联分析后分析策略鉴定奶牛乳成分性状主效基因

该研究旨在基于申请人所在课题组前期已取得的中国荷斯坦奶牛全基因组关联分析（GWAS）研究结果，针对已检测到的52个显著乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率SNPs，采用GWAS后分析策略鉴定奶牛乳脂和乳蛋白性状主效基因。首先根据牛基因组序列数据库和生物信息学技术，对52个显著SNPs所在基因进行电子克隆和功能注释，以确定潜在候选主效基因；然后，采用启动子缺失分析、凝胶阻滞、细胞转染和报告基因、基因表达和蛋白质检测等功能基因组技术研究调控区SNPs的生物学功能；再基于特定细胞系，采用细胞转染技术研究编码区SNPs不同纯合子基因型间的基因表达产物水平和活性；最后，采用RNAi技术在乳腺上皮细胞系验证潜在主效基因是否对奶牛乳脂和乳蛋白性状具有显著影响；从而确定乳脂和乳蛋白性状的主效基因和原因突变。

课题组负责人所在课题组前期开展了中国荷斯坦牛5个产奶性状全基因组关联分析，利用传递不平衡和回归分析同时检测到38个显著SNP位点。（1）基于牛基因组序列草图Btau4.2，采用生物信息学方法针对上述38个显著SNPs鉴定到26个位置候选基因，进一步基于功能注释信息，挑选了10个基因；定量PCR结果显示EEF1D和PDE9A基因在泌乳期奶牛乳腺组织的mRNA表达水平均显著高于其他7个组织，因此，将之作为产奶性状候选关键基因。（2）利用DNA混池测序对EEF1D、PDE9A的全部编码区及上下游各3000bp进行扫描，分别发现了9、11个SNP位点；关联分析进一步表明：EEF1D 5’调控区的3个SNPs、PDE9A 5’调控区的6个SNPs均与部分产奶性状（产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率、乳蛋白率）达到显著或极显著关联，验证了前期GWAS结果，说明两个基因对中国荷斯坦牛产奶性状具有较大遗传效应；软件预测发现上述3个调控区SNP位点改变了转录因子CREB, AML-la and USF的结合，定量PCR结果表明该3个突变位点均改变了目的基因的mRNA表达水平，为功能SNPs。（3）5′RACE分析表明EEF1D在泌乳期奶牛乳腺组织中存在2种转录本，命名为EEF1Da和EEF1Db(KC190039 和KC190038)，二者包含不同的第1外显子（exon1a：294 bp；exon1b：1287 bp）且无重叠，其余7个外显子序列和位置相同；组织表达谱分析显示EEF1Da为主要表达的转录本。（4）通过组织块培养法和差酶消化法，获得了纯化的乳腺上皮细胞系，适用于候选基因功能验证。（5）基于EEF1D的完整mRNA序列，设计了4条siRNA序列，瞬时转染到奶牛成纤维细胞中，定量PCR分析表明，3条siRNA均显著降低了EEF1D的表达量；进一步构建了相应的shRNA载体pGPU6-GFP-NEO-E1357 和pGPU6-GFP-NEO-E1893，同时构建了相应shRNA慢病毒表达载体，转染奶牛乳腺上皮细胞，成功获得了阳性干扰细胞系。（6）基于前期基因定位和精细定位研究结果，本课题通过关联分析发现：UGDH、FASM、SCD和IGF-1等4个候选基因均对中国荷斯坦牛产奶性状具有较大的显著遗传效应。