禾谷镰孢菌TOR途径上关键元件的生物学功能研究

真核生物中的TOR（雷帕霉素的靶标）途径在调控细胞生长、增殖等过程中起重要作用，且与肿瘤发生密切相关。课题组前期研究发现，0.2 μg/ml的雷帕霉素几乎可完全抑制禾谷镰孢菌的生长，禾谷镰孢菌中存在2个同源的雷帕霉素结合蛋白FgFkbp12A和B，FgFkbp12A敲除突变体对雷帕霉素表现抗性，FgFkbp12B敲除突变体丧失致病性，表明，TOR途径在禾谷镰孢菌的生长和致病中起重要作用。在此基础上，本项目将进一步鉴定禾谷镰孢菌中TOR途径上的关键元件及其生物学功能，解析各主要元件间的互作关系，阐明TOR途径对病菌生长、DON合成和致病等性状的调控机制，进而利用TOR途径上关键元件的敲除突变体，筛选针对TOR途径起作用的活性物质，初步评价这些活性物质对肿瘤细胞的抑制作用和对赤霉病的防治效果，研究结果将为抗肿瘤新药物和新型杀菌剂的研发奠定基础。

本研究通过基因敲除和多种蛋白互作技术研究了雷帕霉素对禾谷镰孢菌的作用机制以及TOR 信号途径上8个关键元件的生物学功能及相互关系，发现：1. 雷帕霉素（0.25 μg/ml）对禾谷镰孢菌抑菌效果比多菌灵、戊唑醇的更明显，显微观察发现，雷帕霉素处理后，菌丝膨大扭曲，隔膜变多，并且菌丝内积累了较多脂肪体。另外雷帕霉素还能显著抑制禾谷镰孢菌产孢。雷帕霉素能够特异地与FgFkbp12结合，形成FgFkbp12-雷帕霉素复合体后靶标FgTor的FRB区，抑制FgTor 的激酶活性。2. FgTAP42 的敲除致死，但是FgTAP42 能够部分回补酵母中的温度敏感型突变体（tap42−11）在37℃条件下的生长缺陷。FgTap42 在芽殖酵母和禾谷镰孢菌中的亚细胞定位结果显示在酵母BY4741 tap42−11 中，FgTap42 主要分布在细胞质中，而在禾谷镰孢菌中FgTap42 均匀分布在菌丝的细胞质中，在分生孢子中，则定位于细胞核附近。酵母双杂结果表明FgTap42 能够与FgPp2A，FgSit4 和FgPpg1互作，但是它不与FgTip41 互作。FgTap42 与FgSit4 和FgPp2A 的互作分别被亲和捕捉和Co−IP 再次证实。3. FgPP2A 敲除致死而FgSIT4 或FgPPG1 敲除后，突变体生长严重减慢；而且在雷帕霉素处理后，菌丝内积累的脂肪体比野生型少；ΔFgSIT4 和ΔFgPPG1致病力下降；分生孢子隔膜减少；不能产生子囊壳；FgPpg1 和FgSit4 还通过负调控FgMsg5 而起到正调控细胞壁完整性信号途径（CWI），因此当FgSIT4 或FgPPG1 敲除后，突变体对细胞壁胁迫变得及其敏感；虽然ΔFgSIT4 和ΔFgPPG1 有很多相同表型变化，但是ΔFgSIT4 产孢量和DON 毒素量较野生型并无显著变化而ΔFgPPG1 产孢量下降，DON 量基本检测不到。4. FgTIP41 敲除后，突变体ΔFgTIP41生长减慢，突变体产分生孢子和子囊壳正常，但是致病力下降以及DON产量下降；FgAREA 敲除后，突变体ΔFgAREA在PDA 上生长速率与野生型相差无几，但是菌丝变稀疏，在MM 培养基和以硝酸盐为唯一氮源的MM 培养基上均不能生长，只有在添加铵盐或者谷氨酰胺后才能生长，ΔFgAREA 能够产生子囊壳，在羧甲基纤维素液体培养基中