陆地棉1号染色体物理图谱的构建

本项目旨在形成四倍体棉种DNA纤维荧光原位杂交(FISH)技术的基础上，结合棉花中期染色体FISH技术和粗线期染色体FISH技术，建立一套完善的四倍体棉花FISH技术体系。利用陆地棉单体材料进行1号染色体或染色体特定区段的显微分离，建立相应DNA文库，对文库进行筛查，获得染色体区段的特异性探针，同时从文库中筛选分子标记，加大特定区段遗传图谱的密度，克服分子标记分布不均匀问题。利用特异探针和连锁标记筛选陆地棉BAC文库，获得陆地棉1号染色体BAC克隆与特异标记，进行FISH物理定位，结合遗传连锁图进行对应分析，构建陆地棉1号染色体BAC重叠群。单染色体分离和FISH技术相结合鉴定物理标记、遗传连锁标记及重叠群之间的关系、gap的大小等，再通过染色体步移技术，构建1号染色体的物理图谱。为陆地棉1号染色体基因定位、基因克隆以及基因组测序奠定技术基础。

棉花是世界上最主要的天然纤维作物，部分棉种基因组草图已经绘制完成。陆地棉为异源四倍体，在多倍化进程中积累了大量的重复序列，鸟枪法全基因组测序组装较为困难。利用FISH技术和单染色体分离技术，构建陆地棉1号染色体物理图谱，为棉花功能基因定位、基因克隆以及基因组序列测定、测序完成后的序列装配积累基础资料、提供生物学信息。主要内容有：. （1）棉花FISH技术体系的建立及其应用研究。取棉花根尖，通过固定、低渗、酶解等方法，制备出形态完整、分散良好、背景干净的二倍体和四倍体棉种的中期染色体制片，用5S rDNA、45S rDNA、端粒、着丝粒和gDNA等进行FISH定位和定量研究，揭示了棉花相关序列在不同棉种间的分布，为棉花功能基因研究和棉属进化关系探讨提供新思路。取棉花的花蕾，将花粉母细胞直接酶解、冰醋酸固定并展片，获得形态分散良好、背景干净、区段明显的粗线期染色体。用端粒、着丝粒等DNA进行粗线期FISH定位和定量研究，分析染色体功能区域。取黄化子叶，用“刀切引流法”制备DNA纤维，所制备的DNA纤维平直完整、伸展程度均匀，用gDNA和45S rDNA分别标记探针进行杂交，结果表明所制备的棉花DNA纤维适用于荧光原位杂交，能用于基因组功能序列的拷贝数分析、重叠群连接、gap填补及基因组测序的最终完成。. （2）棉花单染色体显微分离技术体系建立、文库构建和RGA克隆。采用前低渗、酶解、后低渗和压片等结合的方法，制备棉花中期染色体膜制片，激光法分离和收集目标单染色体。染色体酶解去蛋白后经酶切和PCR扩增，产物经Southern和FISH等验证后进行文库构建和RGA克隆。采用此种方法获得了陆地棉1号单染色体扩增池，建立了该染色体文库，获得了9条RGA序列。同样方法获得亚洲棉5号、7号单染色体扩增池，建立了其单染色体文库，并克隆了5号染色体4条RGA序列。. （3）陆地棉1号染色体物理图谱的构建。选取陆地棉1号染色体特异标记23个，在BAC文库中筛查，共筛选出阳性BAC克隆109个，经过初步验证，其中有9个阳性克隆是陆地棉1号染色体特异的，有单一明显信号，经过与遗传图谱对应分析，除有1个阳性克隆位置与遗传图谱位置有出入以外，其他位置与遗传标记具有较好的同源性，在1号染色体上呈线性排列。建立了以整板、行、列三维混合池，菌液PCR为基础的BAC文库快速筛选法。