耐盐菌Bacillus sp.BG-CS10嗜盐纤维素酶嗜盐机制的研究

嗜盐微生物及其产生的嗜盐酶的研究对嗜盐微生物的利用和耐盐嗜盐酶的工业应用都具有重要的意义。我们已经通过改造的鸟枪法从耐盐嗜碱菌Bacillus sp. BG-CS10中克隆到一个新的纤维素酶基因，该基因包含一个纤维素酶结构域和一个未知功能结构域DUF291。异源表达和表征分析发现，2.5 M NaCl能使该纤维素酶的活性提高10倍，使酶的最适温度提高20oC。这些明显不同于已报道的其他纤维素酶。本课题拟继续从三个方面研究该蛋白嗜盐的机制。一是通过蛋白纯化，结晶和X-衍射解析蛋白的结构，探索和嗜盐相关的氨基酸残基和可能的嗜盐机制；二是研究未知功能结构域DUF291的功能和嗜盐的关系。三是通过DLS，CD，NMR等方法研究含有2 M NaCl的CelB蛋白在不同温度下的溶液行为以及盐对其聚集和热稳定性提高的影响。本课题的完成可能为纤维素酶向耐盐方向的进化提供普遍的分子设计的理论基础。

嗜盐微生物及其产生的嗜盐酶的研究对嗜盐微生物和嗜盐酶的工业应用都具有重要意义。研究嗜盐纤维素酶的嗜盐机制可为纤维素酶向耐盐方向的进化提供分子设计的理论基础。. 本项目通过改造的鸟枪法克隆到两个盐相关的纤维素酶基因，并进行了表征。宏基因组来源的纤维素酶CelA是一个盐稳定的酶，3.0 M NaCl提高酶活两倍。耐盐嗜碱菌BG-CS10的纤维素酶CelB，2.5 M NaCl提高酶活10倍。因此继续对CelB进行深入研究，它由纤维素酶结构域和未知功能结构域DUF291组成，2.5 M NaCl也提高了酶的最适温度20 ℃。通过摸索CelB纯化方法与结晶条件，获得了分辨率达到2.5 Å的天然CelB晶体和Se-CelB晶体。X-衍射、结构分析表明，CelB由催化结构域、CBM_X和CBM46三个独立的结构域构成，但是和大多纤维素酶不同的是，两个纤维素结合结构域的去除直接造成酶的完全失活。三个结构域间无弹性蛋白链连接，其表面的芳香族氨基酸拓长了底物结合位点，三个结构域相互联系、缺一不可，共同形成一个紧密的L-构造。CBM_X结构域位于催化结构域右侧，两者依靠氨基酸之间的氢键作用力相互联系，并无经典的连接蛋白。另外，在CBM_X的N末端有一个特殊的环，它将CBM_X、催化结构域以及CBM46紧密联系起来。对其表面的芳香族氨基酸进行突变，酶活性受到一定影响，可能是参与了底物结合过程的原因。CBM46结构域是由一个很大的反向平行β折叠构成的桶状结构，整个结构的稳定主要靠氢键作用力和碱基堆积力。其表面含有很多Try、Tyr和Phe，当去除这些氨基酸时，CelB酶活性会下降，说明这些氨基酸构成了碳水化合物的对接位点。CelB蛋白表面几乎全是带负电荷的酸性氨基酸，直接导致CelB的等电点下降，进而使其表现出嗜盐的特性。. 溶液行为研究表明，纤维素酶CelB至少需要0.15 M NaCl才能保持酶蛋白的均一性；此外，通过动态光散射和小角散射发现含2 M NaCl的CelB在55 ºC时，会寡聚化成线性状态，并且保持活性稳定，但是60ºC时，蛋白会变性，这可能是蛋白在变性前的温度发生寡聚化通过群体效应抵抗热变性。. 总之，通过该项目，已经掌握了嗜盐纤维素酶CelB的酶学性质、晶体结构、耐盐机制和溶液行为等，为纤维素酶向耐盐方向的进化提供了分子设计的理论基础。