CREBH调控溶酶体酸化对肝细胞脂质自噬的影响及机制

Autophagy plays a crucial role in the regulation of lipid metabolism in non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)；however, the mechanism of lipid degradation in lipid overload hepatocytes remains unclear. Our preliminary study showed that cyclic AMP-responsive element binding protein H (CREBH) expression improved autophagy system and lipid content. Furthermore, the literatures and bioinformatics prediction showed that CREBH might regulate ATPase H+ transporting lysosomal accessory protein 2(ATP6AP2) expression to regulate the lysosomal acidification and promote lipophagy. Therefore, in this research project，by using gene overexpression or knockdown or knockout,dual-luciferase reporter genes in NAFLD cell and mouse models, we will explore the roles and mechanisms that CREBH upregulates ATP6AP2 expression to promote lysosomal hydrolysis and lipophagy,which involved in lipid deposition. Our project may provide new theoretical and experimental basis for blocking the occurrence and progression of NAFLD.

自噬调节脂质代谢在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发生发展过程中起重要作用，但是在脂质过载肝细胞中调控自噬有效清除脂质的机制尚不明确。我们课题组在前期工作中发现调控环磷酸腺苷反应元件结合蛋白H(CREBH)的表达可影响脂质过载肝细胞的自噬功能及脂滴含量。结合文献报道及生物信息学检测显示，CREBH极有可能通过调控空泡型质子泵三磷酸腺苷酶(V-H+-ATPase)复合体辅助亚基H+转运ATP酶溶酶体辅助蛋白2(ATP6AP2)的表达，调节溶酶体腔酸化功能，增强脂质自噬而降解脂质。因此，本项目拟采用靶基因过表达与沉默或敲除、双荧光素酶报告基因等技术及NAFLD细胞和动物模型，探讨并阐明CREBH通过转录调控ATP6AP2，促进溶酶体水解功能，增强脂质自噬，从而减少脂质沉积的作用及分子机制，为阻断NAFLD的发生发展提供新的理论和实验依据。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)正逐渐成为慢性肝病的主要病因，影响着全世界高达32%的成年人。持续的肝损伤导致单纯性肝脂肪变性发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，继而出现纤维化，最终发展为肝硬化，甚至肝细胞癌。NAFLD肝损伤的发病机制尚未完全阐明，目前已知其机制是多因素的，涉及胰岛素抵抗(IR)、内质网应激(ERS)、氧化应激、自噬阻滞、脂毒性和低滴度慢性炎症。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白H(CREBH)是一种肝细胞特异性转录因子，通过调控糖脂代谢适应肝细胞应激反应。自噬途径维持细胞内环境稳态，在NAFLD的发生和发展中起着至关重要的作用。然而，在NAFLD中CREBH与自噬途径之间的关系尚不清楚。在本研究中，我们的目的是验证CREBH是否通过调节自噬来抑制NAFLD进展。将慢病毒载体CREBH转染经棕榈酸(PA)处理的LO2和AML12细胞；CREBH基因敲除小鼠和CREBH过表达小鼠分别饲喂高脂(HF)饲料24周、蛋氨酸和胆碱缺乏(MCD)饲料4周。结果表明，在体内、体外过表达CREBH使自噬体标记物LC3-II和自噬底物p62表达降低，溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)的表达增加；此外，敲除CREBH促进LC3-II和p62在体内的异常积聚，导致LAMP1水平降低。这些结果表明，CREBH诱导自噬溶酶体的形成，从而促进了自噬体的降解，有助于改善被阻断的自噬流。然后，为了确定CREBH调控自噬途径的潜在靶基因，我们对CREBH基因敲除小鼠进行了RNA测序(RNA-seq)分析，结果发现了两个候选靶基因，即自噬相关基因14(ATG14)和自噬体-溶酶体融合相关基因Coro1a(Coro1a)。进一步通过染色质免疫沉淀(ChIP)分析和双荧光素酶报告基因分析表明，CREBH直接与Coro1a基因启动子结合，抑制其表达。有趣的是，在PA刺激下，Coro1a在LO2细胞中的过表达导致p62表达显著上调，抑制自噬流，并提高了炎症细胞因子水平。因此，我们的研究表明，在NAFLD中CREBH通过靶向调控Coro1a表达恢复NAFLD中受损的肝细胞自噬流，为NAFLD的治疗提供了一个潜在的靶点。