基于转录因子CtFRMYB1的红花类黄酮调控机理解析及SNP功能标记研究

Safflower is wildly used in Traditional Chinese Medicine for blood circulation drug. The herbs of safflower usually come from oil or oil-medicine varieties with uneven quality. Flavonoids are the main active ingredient for blood circulation in safflower, which is an important indicator for the quality evaluation of safflower. In our previous study, the genes involved in the flavonoid biosynthesis in safflower were screened and identified based on the transcriptome data. The transcription factor CtFRMYB1 was cloned and proved to be involved in flavonoid biosynthesis by regulating the expression of the chalcone synthase gene CtCHS. In this study, based on transcription factor CtFRMYB1, we analyze the regulation mechanism of safflower flavonoid biosynthesis, and then develop flavonoid-associated SNP functional markers, in order to guide the selection and molecular assisted breeding of high quality medicinal varieties of safflower. ChIP-Seq and EMSA experiments were carried out to analyze the regulation mechanism of CtFRMYB1 on the flavonoid biosynthesis safflower in safflower. Association analysis of the flavonoids and the CtFRMYB1 polymorphism was carried out. This work not only has important application value for the screening and molecular assisted breeding of high-quality medicinal varieties of safflower, but also has an important academic significance for elucidating the molecular regulation mechanism of flavonoid biosynthesis.

红花为活血化瘀常用药，但药材来源于油用和油药兼用品种，品质参差不齐。类黄酮是红花的主要活性成分，为红花品质评价的重要指标。申请人前期基于转录组数据全面筛选和鉴定了红花类黄酮合成功能基因，克隆并验证了转录因子CtFRMYB1调控红花类黄酮合成关键基因CtCHS的表达。本研究基于CtFRMYB1解析红花类黄酮调控机理，并以此为基础，开展与类黄酮关联的SNP功能标记研究，以期指导红花优质药用品种的筛选和分子辅助育种。研究采用染色质免疫共沉淀技术与二代测序相结合的ChIP-Seq技术及凝胶阻滞迁移实验，解析CtFRMYB1调控红花类黄酮合成机理；在构建的红花群体中开展CtFRMYB1基因多态性与类黄酮关联分析，筛选与总类黄酮及其主要活性成分相关联的SNP功能标记。此工作的成功开展不仅对阐明红花类黄酮合成的分子调控机理具有重要的学术意义，同时对红花优质药用品种的筛选和分子辅助育种具有重要的应用价值。

红花为活血化瘀常用药，但药材来源于油用和油药兼用品种，品质参差不齐。类黄酮是红花的主要活性成分，为红花品质评价的重要指标。申请人前期基于转录组数据全面筛选和鉴定了红花类黄酮合成功能基因，克隆并验证了转录因子CtFRMYB1调控红花类黄酮合成关键基因CtCHS的表达。本研究在前期研究基础上，构建并完善了红花花原生质体制备和转化体系，利用红花花原生质体体系证明CtFRMYB1还能调控类黄酮合成功能基因（CtC4H2、CtF3H4、CtHCT12）表达，启动子活性分析表明CtFRMYB1能促进类黄酮合成功能基因启动子（pCtHCT12、pCtCHI2）活性。完成红花群体遗传多样性分析，筛选得到了16对条带清晰且有明显差异的SSR引物，可作为遗传标记引物。项目利用Biacore分子互作实验研究了CtFRMYB1调控类黄酮基因表达机理，结果表明CtFRMYB1结合了“CAACCA”元件来调控类黄酮基因表达。项目分析了CtFRMYB1基因在构建红花群体中的多样性，初步筛选了优异SNP位点，发现其中在32位点突变，同总黄酮关联较大，可为红花候选SNP位点。项目研究了植物激素MeJA对红花类黄酮的调控机理，综合代谢组学和转录组学分析表明，MeJA可上调类黄酮生物合成途径上游基因(如CHSs、CHIs和HCTs)的表达，下调下游基因(如F3Ms、ANRs和ANSs)的表达，从而促进醌式查尔酮的生物合成。同时分析了不同光照条件下红花花类黄酮合成的基因表达影响，对不同光照条件下培养的红花进行了转录组分析。本研究还对红花花色形成机制进行研究，表明在白色和黄色花朵中检测到更多的黄酮类代谢物质但是在白色花朵中未发现C-葡萄糖基喹查耳酮，推测查尔酮合酶 (CHS) 基因的差异表达是导致不同类黄酮种类和含量差异的主要原因之一。总之，通过项目的开展，研究了红花药效成分的调控合成，分析了CtFRMYB1调控红花类黄酮合成机理，在红花群体中开展CtFRMYB1基因的遗传多样性分析，初步筛选了优异SNP位点，为红花优质药用品种的筛选和分子辅助育种奠定了基础。