CLOCK与SLC25A10蛋白质互作对线粒体代谢的作用机制研究

There is a close correlation between the circadian genes and metabolism. Our previous study found that circadian CLOCK protein located in the mitochondria and interacted with a mitochondrial carrier protein SLC25A10. Therefore, we propose that CLOCK can bind to SLC25A10 and acetylate SLC25A10, thereby regulate mitochondrial respiratory function and eventually affect the body's energy metabolism. We will first use protein pull-down technology, surface plasma resonance technology to verify the binding capacity of the two proteins as well as find the key acetylation sites in SLC25A10 through the point mutation method. Metabolomics will be subsequently used to study the changes of SLC25A10 transportation related substrates. The Seahorse facility will be used to study the mitochondrial respiratory metabolism and functional changes of various mitochondrial respiratory complexes. Finally, we will establish SLC2510A point mutant mice, metabolic cages and other methods will be used to study the impact of mutations on mitochondrial function and metabolism in vivo to clarify the above mechanism. Our study will provide an important experimental basis for the regulation roles of circadian gene clock in mitochondrial metabolism.

生物钟基因与代谢之间具有明显相关性。我们前期研究发现部分生物钟CLOCK蛋白分布于线粒体，并与线粒体膜转运蛋白SLC25A10之间存在相互作用。故提出假说，CLOCK蛋白可能通过乙酰化SLC25A10，影响了线粒体膜内外物质转运来调节线粒体代谢功能，进而影响整个机体的代谢水平。我们首先将利用蛋白质pull-down技术、Surface Plasma Resonance技术进一步验证二者的结合能力，找到SLC25A10上的结合位点和乙酰化位点；利用代谢组学方法研究点突变SLC25A10细胞内转运相关底物的改变，利用海马XF系统检测细胞线粒体呼吸代谢功能改变；最后，在体外建立SLC25A10结合序列突变和乙酰化位点突变的小鼠，研究其对线粒体代谢的重要作用和相关表型，并在分子水平上进一步验证上述作用的机制。本课题将为研究生物钟基因调节线粒体与物质和能量代谢提供新的实验基础。

生理功能和代谢调节是哺乳动物昼夜钟控制的最重要输出。线粒体呼吸和ROS产生表现出节律性活动。负责线粒体物质转移的线粒体载体对线粒体代谢至关重要。时钟（昼夜运动输出周期Kaput）是哺乳动物中发现的第一个核心昼夜节律基因。然而，CLOCK蛋白是否能通过线粒体载体调节线粒体功能尚不清楚。生物钟基因与代谢之间具有明显相关性。我们前期研究发现部分生物钟CLOCK蛋白分布于线粒体，并与线粒体膜转运蛋白SLC25A10之间存在相互作用。故提出假说，CLOCK蛋白可能通过乙酰化SLC25A10，影响了线粒体膜内外物质转运来调节线粒体代谢功能，进而影响整个机体的代谢水平。本次我们发现CLOCK可以与线粒体载体SLC25A10直接结合。为了进一步分析，我们使用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了Slc25a10−/−-Hepa1-6细胞系。Slc25a10−/−-Hepa1-6细胞表现出葡萄糖稳态紊乱、氧化应激水平升高和电子运输链受损。接下来，使用免疫沉淀分析，我们发现SLC25A10中的氨基酸43–84和169–210是响应CLOCK结合的关键位点。最后，野生型SLC25A10在SLC25A10−/−-Hepa1-6细胞中的强制表达可以补偿SLC25A0的损失；葡萄糖代谢降低、严重氧化应激和受损的电子传递链得以恢复。我们发现PUF60通过调节Drp1 mRNA的稳定性直接维持线粒体稳态，而与CLOCK的关联可以竞争性地抑制这一功能。在Clock△19小鼠中，Clock△19 释放PUF60，导致Drp1 mRNA稳定性增强和线粒体持续分裂。我们发现生物钟蛋白BMAL1通过线粒体自噬的调节心肌功能；发现CLOCK的乙酰化酶功能可以通过调节PDIA3的乙酰化，进而影响软骨发育，并导致小鼠关节的早衰。总之，我们的工作揭示了生物钟蛋白CLOCK与线粒体关系的紧密连接。对于今后线粒体相关代谢紊乱提供了重要的参考。