太平洋牡蛎新型模式识别受体NLR的克隆、功能和信号途径的研究

NOD样受体（NLR）是最近发现的一类新的模式识别受体家族，在脊索动物、棘皮动物等后口类动物中普遍存在且高度保守，然而，原口动物中是否存在其同源基因一直是未知的。出人意料的是，在太平洋牡蛎中首次发现了NLR的EST，证明了在软体动物可能存在NLR的同源基因。但是，太平洋牡蛎NLR是否具有同哺乳动物保守分子结构和功能？是否具有类似的免疫识别模式和下游信号通路？所有这些问题尚无答案，这也构成本次申请的主要研究内容。我们拟在太平洋牡蛎NLR的EST基础上，克隆其全长基因序列，分析其免疫反应中的表达模式；运用SPR和细胞模型等技术研究其免疫识别机制；利用酵母双杂交、Pull-down和免疫共沉淀等技术鉴定NLR信号通路的关键信号转导因子，揭示其信号转导途径。因此，本研究不但对阐明NLR在海洋无脊椎动物天然免疫的作用和分子机制有重要意义，而且对于理解和探索NLR的起源和演化规律都有着深远的意义。

通过生物信息学结合分子克隆的方法，成功的从太平洋牡蛎的cDNA文库中获得了模式识别受体NLR的全长序列。其ORF编码了740个氨基酸，具有一个HELIC结构域，一个CARD结构域和八个串联重复的LRR结构域。表达分析显示NLR在多个组织中广泛性表达，并且发现血淋巴细胞中的NLR mRNA表达对 Glucan、Larminarin和ODN2006具有明显的响应性。细胞转染实验显示，NLR一方面可以激活NF-kB报道基因活性，并且ODN2006可以特异的激活NLR依赖的NF-kB激活。系列缺失实验显示N-端HELIX可能是一个抑制性结构域，LRR可能在NF-kB激活中发挥着作用。不论缺失N-端HELIX或者C-端LRR结构域，NLR都失去了对ODN2006的反应性，推测这两个结构域都是识别ODN2006后激活信号传导所必须的。因此，牡蛎NLR可以作为模式识别受体，具有激活NF-kB和识别ODN2006的能力，并且在牡蛎的天然免疫中发挥着重要的作用。同时，我们克隆鉴定了模式识别受体TLR的4个家族成员，它们具有保守的结构域，并且同脊索动物具有非常近的分子距离。在HEK293细胞中，每个TLR都可以激活NF-kB报告基因，但是在不同的PAMPs刺激下却不能诱导TLR依赖的NF-κB激活。亚细胞定位显示各个TLR成员分布相似，在细胞质膜和内涵体中以双重表达。TLRs 与MyD88在应答PAMP刺激中呈高度一致的应答模式。同时我们还设计了一个TLR信号的抑制剂，结果表明阻断TLR信号可以抑制弧菌感染引起血细胞脱颗粒和TNF mRNA的激活。因此，TLRs信号在牡蛎的感染过程中，发挥着重要的作用。此外,我们还分析了抗菌肽BPI和效应因子catalase,揭示它们分别在牡蛎清除G-菌和抗H2O2过程中都发挥着重要的功能。