Na+-K+-ATPase特异性DR抗体对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护及分子机制研究

Ischemia-reperfusion (I/R) is the main reason for myocardial injury; the underlying mechanisms are not fully uncovered. Improvement Na+-K+-ATPase (NKA) activity are a potent target for treating I/R injury. However, this research has been in a blank because no effective agonist can be used to enhance NKA activity. Our previous study has found that NKA DR region specific antibody (DR-Ab) stimulated NKA activity, stabilized NKA membrane expression. Based on the previous work, the following subjects will be investigated in this present project: 1), confirming the protective effects of DR-Ab on both in vivo and in vitro cardiac ischemia-reperfusion injury model and detecting NKA activity and membrane expression in these model; 2), detecting which factors influence NKA activity and membrane expression, analyze the origin of DR-Ab protect effect; 3) screening the important factors that influence DR-Ab protecting effect, interfere these factors to examine the underlying mechanisms and signaling pathway of DR-Ab protect effect; 4) inhibit or activate NKA activity in I/R injury model, analyses the different signaling pathway between two models and confirm it, thus elucidate the molecular mechanism between NKA and I/R injury. These results will confirm a specific molecular target for protecting I/R injury, deepen NKA role in I/R injury and provide new strategy for the prevention and cure of I/R injury.

缺血/再灌注（I/R）是心肌损伤的主要原因，增强Na+-K+-ATPase（NKA）活性是治疗心肌I/R损伤的潜在靶点，但缺乏有效的激动剂。我们前期发现，针对NKA DR区段的抗体（DR抗体）能够增强NKA活性，稳定其在心肌细胞膜的表达。本课题拟在大鼠心肌细胞和组织I/R损伤模型中，检测DR抗体的保护作用以及NKA活性和细胞膜表达；通过多种分子手段筛查影响NKA活性及细胞膜表达的关键因子，分析DR抗体作用途径；从已知的I/R损伤机制入手，筛查DR抗体保护心肌的关键因子，抑制剂或激动剂干预关键因子，确定DR抗体作用的信号通路和分子机制；分析NKA激活或抑制在I/R损伤中的作用及信号通路差异点，在细胞和组织中进行反向验证，阐释激动或抑制NKA调控I/R损伤机制。课题研究不仅能获得预防I/R损伤的靶向分子，拓宽NKA在缺血/再灌注中的作用机制，也为阐明I/R损伤发生机制提供新思路。

项目背景: 心肌缺血/再灌注损伤是急性心肌梗死的主要损伤原因。氧自由基增加、钙超载、细胞坏死和凋亡因素在心肌缺血/再灌注损伤中发挥中重要的作用。缺血/再灌注损伤中常常伴有Na+-K+-ATPase活性或表达抑制的现象。提高Na+-K+-ATPase活性很有可能是抑制心肌缺血/再灌注损伤的新靶点。.主要研究内容:本课题制备针对DR区段的特异性单克隆抗体DRm217，对其免疫学及生物学特性进行了鉴定。深入研究DRm217增强Na+-K+-ATPase活性在心肌缺血/再灌注损伤中的作用。并进一步探讨了DRm217产生保护作用的分子机制。.重要结果及关键数据: 自本年度项目启动以来，获得的代表性数据如下：①制备了针对Na+-K+-ATPase DR区域的单克隆抗体杂交瘤细胞株，生成纯化了DRm217单克隆抗体,对DRm217进行了生物学及免疫学活性鉴定。结果证实DRm217能够特异性识别结合DR多肽、能够提高Na+-K+-ATPase活性。② DRm217抑制H2O2引起的心肌细胞损伤。以H2O2处理H9c2心肌细胞，模拟活性氧造成的心肌细胞损伤模型。检测DRm217对活性氧造成的心肌细胞损伤是否具有保护作用。实验证实DRm217抑制 H2O2引起H9c2细胞；DRm217保护机制与稳定Na+-K+-ATPase细胞膜表达、抑制细胞内Ca2+离子浓度异常增高以及降低细胞内ROS含量有关。③ DRm217抑制缺血再灌注引起的心肌细胞损伤。我们以缺氧/再灌注处理的H9c2细胞为细胞模型，心脏缺血/再灌注手术处理SD大鼠为动物模型，从细胞和动物模型上分别探讨DRm217对缺血再灌注损伤的保护作用及机制。实验证实DRm217能够抑制缺血再灌注损伤造成的心肌细胞活力下降、抑制心肌细胞凋亡、对大鼠心脏缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，并发现其保护机制与激活PI3K/Akt、ERKs，稳定Na+-K+-ATPase细胞膜表达、抑制Src磷酸化、干扰Na+-K+-ATPase/Src/ROS通路活化有关。.科学意义:本研究从细胞及动物模型上观察了Na+-K+-ATPase DR区段特异性抗体DRm217对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用, 研究了DRm217产生保护作用的分子机制，探讨了Na+-K+-ATPase在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制，具有一定的理论价值和潜在的应用前景。