超声微泡介导SIRT1基因对退变椎间盘调控作用及相关机制研究

The research of delaying disc degeneration is hot pot by the exogenous gene transfected.SIRT1 can regulate many functions in cell metabolism, our early findings showed that resveratrol (an SIRT1 activator) can protect nucleus pulposus cells (NPCs) from apoptosis and promote the synthesis of extracellular matrix，we also found that the low intensity impulse ultrasound can promote synthesis of extracellular matrix of degenerative human nucleus pulposus cell by PI3K/Akt pathway .In the first part of this project, ultrasound microbubble-mediated SIRT1 was used to transfect in-vitro 3D-cultured NPCs by ultrasound targeted microbubble destruction (UTMD). Targeted regulation of high expression and silencing of SIRT1 were conducted to observe its regulating effects on the synthesis of extracellular matrix and cell apoptosis.We further investigate its relationship with the canonical Wnt/β-catenin pathway.In the second part, with the help of percutaneous transfomainal ednoscopic discectomy (PTED) technology, the ultrasound microbubble-mediated SIRT1 and SIRT-shRNA were used to transfect canine models with intervertebral disc degeneration, and thus to investigate its in-vivo curative effects on IVDD. With these in-vivo and in-vitro experiments, we expect to reveal the exact regulative mechanisms of SIRT1 on the degenerative intervertebral disc.The project will provide new clues for understanding the pathogenesis and treatment of IVDD.

外源性基因转染椎间盘细胞延缓其退变进程是近年来的研究热点。SIRT1能调节细胞代谢的诸多功能，我们前期研究揭示SIRT1能通过Akt通路抑制人退变椎间盘髓核凋亡，SIRT1激动剂可保护髓核细胞的凋亡和促进胞外基质的合成；同时，低强度脉冲超声可通过PI3K/Akt通路促进人退变髓核细胞外基质合成。本研究拟通过超声微泡介导SIRT1基因转染体外三维培养的髓核细胞，靶向调控SIRT1的高表达和沉默，观察其对胞外基质合成和细胞凋亡的调控作用，研究与经典Wnt/β-catenin通路之间的相互关系。采用微创导针将超声微泡介导的SIRT1与SIRT-shRNA转染犬椎间盘退变模型，椎间镜通道超声探头击破SIRT1超声微泡，观察其在体内对椎间盘退变靶向调控表达的影响作用。进一步阐明SIRT1对退变椎间盘髓核细胞胞外基质合成和细胞凋亡靶向调控的确切机制，为研究椎间盘退行性疾病发病机制及治疗提供新的思路。

近年来众多基础研究已经在体外证明了许多细胞因子、基因或药物对椎间盘退变具有明显的延缓作用，但尚缺乏高效、安全的载体将其运载到体内，发挥真正的生物学效应。课题组首先在体外细胞学证实通过多次、反复低强度超声辐照可以促进髓核细胞胞外基质合成。我们进一步通过双乳化法合成了载白藜芦醇的PLGA纳米微泡，并通过碳化二亚胺法在微泡表面衔接了CDH2靶标，使其对椎间盘髓核细胞具有高效靶向性。Laser Particle Size Analyzer System检测结果显示其直径约为（567.3±114.7）nm，zeta电位（−12.14±5.58）mV，具有良好的载药量和包封率。体外研究证明该类型微泡对退变髓核细胞具有良好的靶向性，且通过联合低强度聚焦超声辐照可以有效释放包含在内的药物，使髓核细胞SIRT1过表达，从而进一步抑制其细胞凋亡、促进胞外基质合成表达。通过针刺法构建兔椎间盘退变模型，向椎间盘内直接注射该靶向载药纳米微泡联合超声辐照，8周后与假手术组和非靶向载药微泡组比较发现，其在体内有效延缓了椎间盘退变。从体内、外实验中证明了纳米靶向载药微泡的生物安全性和治疗有效性，具有一定的临床应用前景。. 同时本课题组将该纳米微泡技术延伸应用至脊髓损伤治疗，合成了载神经生长因子质粒的纳米微泡，通过尾静脉注射治疗脊髓损伤大鼠模型，取得了积极的效果。我们还在前期研究基础上进一步探索了SIRT1基因对椎间盘退变的调控机制，研究发现SIRT1可以通过激活自噬和抑制TLR2/NF-κB信号通路保护髓核细胞凋亡。此外课题组还发现SIRT1对椎间盘软骨终板的退变同样具有保护作用；IL-1β通过线粒体途径来诱导髓核细胞凋亡，但同时激活的线粒体自噬可以部分保护其凋亡进程。. 课题组一共培养博士研究生6人，硕士研究生6人，发表SCI 14篇，总影响因子50.3分，在国内学术会议中交流2次，并以本项目的研究成果作为主要内容申报并获得2017年重庆市科技进步奖一等奖。