TRPM2介导干眼氧化损伤与NLRP3炎症小体活化的机制研究

Dry eye syndrome (DES), the second top eye disease in the outpatients, is a multifactorial disease with potential damage to the ocular surface. Our recent studies demonstrated that excessive ROS generated in ocular surface under environmental stresses, stimulates NLRP3 to form NLRP3 inflammasome, which activates the secretion of IL-1β and primes the inflammation in DES. However, how ROS activate NLRP3, which plays a central role in explicating this mechanism and may guide the therapeutics of DES, is still unclear. There have been studies provided cues that TRPM2 might links ROS and the induced NLRP3 activation, however TRPM2 needs further investigation in DES. This study aims to evaluate in human permanent corneal and conjunctival epithelial cells cultured in high-osmolality media, the expression of TRPM2, NLRP3 inflammasome components (NLRP3, ASC, Caspase1), and IL-1β with or without the use of TRPM2 activator H2O2 or inhibitor ACA; and the knock-down and knock-up of TRPM2 in these cells are conducted to validate the effect of TRPM2 on NLRP3 system in the development of DES. Furthermore, we use a dry eye mouse model induced by the intelligently controlled environmental system (ICES), to investigate the expression and the association of the above factors in mouse ocular surface tissues with or without the use of TRPM2 inhibitor ACA.

干眼是眼科门诊患者中的第二大眼病。最近研究发现眼表组织在环境压力下产生的ROS增加激活NLRP3受体使炎症小体活化，进而启动干眼炎症反应并导致发病。但此机制中ROS如何激活NLRP3受体的具体机制仍不明，而这又是明确干眼发病启动程序并指导干眼治疗的关键所在。已有研究提示TRPM2可能是连接ROS与NLRP3活化的中间门控通道蛋白，但这在干眼中的研究仍是空白。本课题通过体外高渗培养角膜和结膜上皮细胞，利用TRPM2激动剂（过氧化氢）和抑制剂(ACA)处理，分析TRPM2与NLRP3的相关性；并通过上调和下调TRPM2表达，验证其调控NLRP3的具体机制。并建立环境因素诱导小鼠干眼模型，利用TRPM2抑制剂ACA，检测眼表TRPM2和NLRP3炎症小体的表达变化，活体验证TRPM2与NLRP3的相关性，以深入研究TRPM2在干眼ROS与NLRP3活化中的具体作用，为干眼的根本性治疗提供新思路。

干眼是以免疫炎症反应为重要特征的眼表疾病，泪液高渗引起ROS增加的激活氧化损伤和炎症是干眼发病中的关键因素，本研究组前期研究表明ROS能激活NLRP3组合生成NLRP3炎症小体，但对于ROS是如何介导NLRP3激活及炎症小体形成的具体机制尚不明确，TRPM2在先天性免疫和炎症的调节机制上发挥重要作用。本研究证实TRPM2是在干眼的发病过程中连接氧化应激和NLRP3炎症小体的关键点。.本课题通过高渗诱导原代培养角膜上皮细胞，利用TRPM2激动剂或抑制剂处理，上调或下调TRPM2表达，分析TRPM2与NLRP3表达的相关性，并验证其调控NLRP3的作用。最后建立环境因素诱导小鼠干眼模型，检测TRPM2和NLRP3炎症小体的表达变化并验证的其相关性。角膜上皮细胞经过高渗培养液培养4h后，TRPM2、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β基因水平和蛋白水平的表达升高，相似的在过氧化氢处理TRPM2蛋白表达也上调，同时诱导NLRP炎症小体的激活和IL-1β的分泌，而使用TRPM2的抑制剂ACA处理后，所有这些升高的表达均被抑制。使用干扰RNA下调的高渗处理组TRPM2的表达，进而NLRP3、caspase-1和IL-1β的基因和蛋白表达均受到抑制。而在ICES暴露1周后的小鼠动物模型组，TRPM2和NLRP3炎症小体和IL-1β的基因和蛋白水平较正常组明显升高，使用ROS抑制剂0.03%Mito Q滴眼液后，有效的抑制ROS的表达生成和小鼠角膜荧光素染色，同时也下调了TRPM2表达，而NLRP3和IL-1β的基因水平和蛋白水平随之下降。.本研究在角膜上皮细胞中发现TRPM2在细胞高渗刺激下表达明显增加，而且与NLRP3及炎症因子表达一致性增高，而通过ACA下调TRPM2的表达可明显降低炎症小体及炎症的表达。通过过氧化氢/siRNA干扰上调和下调TRPM2表达，证实了TRPM2调控ROS-NLRP3炎症小体通路，扩展了其在干眼由高渗-氧化应激-炎症通路调控途径的理解。而后在干眼小鼠模型中证实TRPM2在ROS-NLRP3炎症炎症激活通路的调控作用。其创新之处在前期NLRP3炎症小体是介导干眼炎症因子释放的启动环节，进一步明确在干眼中验证ROS-TRPM2-NLRP3炎症小体和炎症通路的激活和调控机制，深入研究干眼的炎症启动机制，为干眼的早期诊断和治疗提供新思路。