抗肌球蛋白9自身抗体在特发性膜性肾病发病中的作用研究

特发性膜性肾病（IMN）是人类肾病综合征重要的病理类型，在我们既往的研究中发现IMN患者存在抗肌球蛋白9（MYH9）的自身抗体，并已成功建立了该疾病的大鼠模型，但该抗体在IMN发病中的作用及对足细胞的影响需要更深入研究。本项目拟：⑴用蛋白印迹和ELISA法观察该抗体与IMN患者疾病发生发展的关系，通过血清学检查帮助临床诊断和疗效观察；⑵用免疫亲和层析法分离IMN患者血清特异性抗体，注射给大鼠观察能否进行该疾病模型的复制；⑶用细胞培养、MYH9基因转入、干扰和嘌呤霉素损伤体外模型等观察该抗体对足细胞结构与功能的影响。⑷研究该动物模型中肾小球上皮下免疫复合物沉积的发生机制。通过该原始创新性研究项目初步明确抗MYH9自身抗体在IMN中的致病作用，为进一步探索IMN的发病机制、进行针对靶抗原的治疗提供理论基础。

第一部分 myosin 9蛋白是特发性膜性肾病重要的靶抗原之一.特发性膜性肾病（IMN）是成人原发性肾病综合征最常见的病理类型。我们以前发现，肌球蛋白9（myosin9)，属于家族收缩蛋白，并且也被称为非肌肉肌球蛋白重链IIA（NMHC-IIA），是在IMN的动物模型的靶抗原。为了进一步验证其在IMN的发病中的作用，我们首先证明了227-KDa的肌球蛋白9，在足细胞胞浆表达，在185-KDa的M型受体分泌磷脂酶A2（PLA2R）共同定位在人足细胞，且可被IMN患者血清抗体识别。使用还原和非还原免疫印迹方法，40例IMN患者血清中，30（75％）例显示出有抗myosin9抗体，32例（80.0％）可检测出抗-PLA2R抗体。 ELISA实验与免疫荧光均表明，IMN血清含有明显高于其他肾小球疾病以及正常对照的抗myosin9抗体的浓度，且是在IMN患者肾小球基底膜特异性存在。这些研究结果均提示肌球蛋白9，类似于PLA2R，是IMN的发病机制是必不可少的靶抗原之一。.第二部分Myosin 9 蛋白C末端B细胞抗原表位多肽的制备及致病性的鉴定.目的：预测足细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（myosin 9） C末端B细胞抗原表位，备myosin9抗体，并对其特异性进行鉴定,明确myosin9在膜性肾病发病机制中的作用。.方法：以myosin 9 C末端氨基酸序列为基础，应用公共的生物信息学工具，借助专业的B细胞表位预测工具预测潜在的B细胞表位，评判其最有可能的B细胞表位。人工合成该B细胞表位多肽，免疫新西兰雄性大耳白兔，制备出特异性抗体,探讨其抗体的生物学作用。.结果：综合分析多种生物信息学工具表明，myosin 9 C末端14个氨基酸区段具有极大地B细胞表位可能。筛选出目标蛋白条带，并通过质谱分析方法明确该蛋白即为myosin 9。且当免疫时间达8周以上，兔抗抗原表位血清中成份检测出PLA2R抗体（非还原型免疫印迹）。.结论：应用生物信息学成功预测出的myosin 9 C末端B细胞抗原表位，且动物模型提示B细胞抗原表位扩散的可能，为进一步研究特发性膜性肾病的发病机制奠定基础。