控制水稻种子休眠和每穗粒数多效性基因DGN4的分子机理解析

Dormancy is an important agronomic trait closely related with yield and quality of rice. Compared to cultivated varieties with non-deep dormancy or non-dormancy, wild rice has a characteristics of deep dormancy. In previous studies, we mapped a loci controlling dormancy to an 100 Kb interval using near isogenic lines derived from Dongxiang commom wild rice (Oryza rufipogon Griff.) and a cultivated variety Zhenshan 97. Meanwhile, this loci also increased grain number per panicle and delayed heading date. We named this loci DGN4(Dormancy and Grain Number). After bioinformatic analysis of this 100Kb interval, we chosed two ORFs as candidate genes and conducted genetic transformation to verify the function of DGN4. The ORF1 overexpression lines showed delay seed germination, increased grain number per panicle and longer heading date. Next we will use various of molecular biology techniques to study the identity of DGN4 including the mechanism why DGN4 has multi-effects and the relationship between DGN4 and phytohormone ABA . Also, we will analyze the nucleotide polymorphism and the evolutionary feature of DGN4 through sequencing a variety of wild rice and cultivated rice.

水稻的休眠是与水稻的产量和品质紧密相关的农艺性状，和栽培稻的浅休眠或者无休眠相比，野生稻具有较强的休眠特性。我们利用江西东乡普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）和栽培稻珍汕97构建的近等基因系将第四染色体上的一个休眠基因定位到100kb的范围内，同时，该基因还有增加每穗粒数和延迟抽穗期的效应,我们将其命名为DGN4（Dormancy and Grain Number）。通过生物信息学分析，我们在这100kb的区间选择了两个候选基因（ORF1和ORF2）进行转基因功能验证。目前我们已获得了超表达ORF1的表型：延迟种子萌发，增加穗粒数和延长抽穗期。下一步我们将运用多种分子生物学技术解析DGN4的功能，包括DGN4一因多效的机理，DGN4与激素ABA的关系等。同时我们将通过对野生稻和栽培稻的测序来分析DGN4的核酸多样性以及进化特点。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，水稻的抽穗期、穗型以及种子休眠都是影响水稻产量和品质的重要因素。在本研究中，我们解析了水稻DGN4/OsMFT1基因在抽穗期、穗型、种子休眠等方面的功能和调控机理。.我们构建了OsMFT1的超量表达和基因敲除的转基因材料。超量表达OsMFT1显著延迟抽穗期，并且极大地增加二次枝梗数和每穗颖花数。敲除OsMFT1显著减少每穗颖花数和二次枝梗数，抽穗期稍微提前。超表达OsMFT1可以显著抑制Ehd1、Hd3a、RFT1、OsMADS14的表达量。我们用Ghd7的抑制材料和OsMFT1的超表达材料杂交， F2的表型分析显示，在调控抽穗期和穗型方面，OsMFT1位于Ghd7的下游。因此，在开花期调控上，OsMFT1位于Ghd7的下游，Ehd1的上游。 我们通过酵母单杂交、EMSA和双荧光素酶活实验证明了转录因子OsLFL1可以直接结合在OsMFT1的启动子上并激活OsMFT1的表达量。为了解析OsMFT1调控穗型的机理，我们检测了超表达OsMFT1和野生型的0.5-1 mm幼穗中的差异表达基因，发现FZP和SEPALLATA-like基因在超表达OsMFT1的幼穗中被显著地抑制，RNA原位杂交实验进一步验证了这一结果。FZP和SEPALLATA-like基因是水稻穗发育过程中小穗分生组织起始的标志基因，它们的表达量被抑制就意味着超表达OsMFT1的幼穗中枝梗分生组织向小穗分生组织的转化被延迟，因此可以分化出更多的枝梗。此外，超表达OsMFT1的种子发芽速率则显著的比野生型缓慢。进一步检测转基因植株中ABA信号途径基因Lea3和Rab16A的表达量，我们发现OsMFT1可以在RNA水平上调这两个基因的表达量。我们通过酵母双杂交筛库筛到了3个与OsMFT1互作的bZIP转录因子，OsbZIP23、OsbZIP66和OsbZIP72。BiFC实验和pull-down实验证实了他们之间的蛋白互作。这表明，OsMFT1很有可能是通过与bZIP转录因子互作来正调控ABA信号通路，从而调控种子萌发。