甘蓝花粉管钙感应蛋白编码基因的克隆与序列分析

花粉管在柱头上的萌发伸长是甘蓝异交亲和性的关键，对其分子机理的探索一直是一个国际前沿研究热点。通过国际前沿研究现状和发展动态分析，我们推测：甘蓝异花花粉不含与柱头特异识别的SCR，而是可能含有长半衰期发育阶段预存性钙感应蛋白，其表达部位与钙信号的存在无关，而到达功能部位的过程却受到柱头分泌钙液的诱导，所引发的SC过程与SI相异甚至局部相反。因此，我们不能用差别显示法或者引物扩增等方法克隆和分析这种蛋白的编码基因。本项目采用新颖的方法和技术路线，对甘蓝异花花粉钙感应蛋白编码基因进行克隆和序列分析。项目的成功，可望为甘蓝花粉伸长的分子机理作出新发现，为植物受粉机理的深入研究提供新内容，为植物分子遗传育种新方法的产生提供新思路。

为探索钙感应蛋白对于花粉萌发和花粉管伸长的作用，以结球甘蓝高代自交不亲和系E1和F1为材料，构建了其花粉体外高效萌发的实验体系。随后通过双向电泳试验共分离鉴定成功了42个花粉萌发前后显著变化的蛋白点，其中获得了钙调蛋白、类钙调蛋白和膜联蛋白等3个钙感受蛋白信息，通过同源扩增及RACE等方法从甘蓝中获得了编码相应钙感受蛋白CaM12、Annexin D2和CML49的全长cDNA序列，同时获得三者的gDNA序列，分别对三基因进行序列分析。同时对我们进一步分析了钙调蛋白上4个EF-hand模体、类钙调蛋白2个EF-hand模体对于钙离子结合及其构象完整性，利用定点突变将CaM12、CML49蛋白的EF-hand结构域中的关键位点进行突变，进而分析突变后对蛋白功能的影响。从甘蓝柱头中扩增得到SRK7基因单倍型，进行序列分析，并亚克隆得到SRK7的胞外域（eSRK7，不含信号肽）与胞内激酶区（iSRK7，不含跨膜域），分别构建原核表达载体和酵母表达载体。利用Pull-down、酵母双杂交系统等蛋白相互作用分析方法对钙调蛋白CaM12、类钙调蛋白CML49与SRK7及其亚域的相互作用进行了分析，表明CaM12和CML49均能与SRK7发生相互作用，CaM12与iSRK7发生相互作用，而CML49与eSRK7发生相互作用。从番茄基因组中扩增得到花粉特异性启动子Lat52，并在甘蓝中验证该启动子能够启动GUS报告基因的表达。构建类钙调蛋白编码基因的在CaMV35S和Lat52启动下的反义表达载体并进行反义遗传转化，获得反义转化的转基因植株，通过PCR、Southern杂交等分子检测确定对甘蓝的成功转化。通过上述研究以期获得在花粉与柱头相互识别机制中钙感应蛋白的作用与钙离子信号的传导等相关信息。