大葱细胞质雄性不育候选基因atp6的克隆与功能研究

Bunching Onion （Allium fistulosum L.）,which belongs to Liliaceae family of Allium genus, its hybrid has the extensive application prospect because of the strong heterosis. Cytoplasmic male sterility (CMS) is one of indispensable avenues for F1 hybrid seed production in bunching onion. However, despite the importance of CMS, the studies of CMS are very rather rare, especially in genes cloning, expression and biological function. In the previous researches, polymorphic fragments had been obtained in male sterility line and maintainer line. Its homology with atp6 pseudogene (JQ283733.1) in bunching onion from GenBank was up to 99%, with atp6 gene（GU253299.1） in onion up to 96%. In this project, we will develop the marker on N cytoplasm to apply the maintainer line breeding. The atp6 gene will be cloned by TAIL-PCR. Real-time PCR will be used to research the atp6 gene expression stage and positions. Gene functional complementation analysis will be designed in this experiment to identify the atp6 gene function. This project will clear the relationship of atp6 gene and male sterility and provide the basis for elucidating the molecular mechanism of male-sterility in bunching onion.

大葱（Allium fistulosum L.）为百合科葱属植物，杂交优势强，利用大葱雄性不育生产杂交种是必不可少的途径之一。然而国内外关于大葱雄性不育相关基因的克隆、表达及功能研究却相对较少。在前期研究中，我们利用同源克隆的方法，在大葱雄性不育系和保持系中得到多态性片段，经测序分析，其与大葱atp6 pseudogene (JQ283733.1) 具有99%的同源性，与洋葱atp6 gene（GU253299.1）具有96%的同源性。本项目拟开发大葱N型细胞质特异标记，用于保持系筛选；采用TAIL-PCR的方法，得到大葱atp6基因序列全长；通过Real-time PCR 进行mRNA差异表达分析，研究atp6基因在不同生长发育阶段的表达情况；利用基因互补验证的方法研究atp6基因的功能。明确该基因与大葱细胞质雄性不育的关系，为揭示大葱细胞质雄性不育分子机制提供依据。

大葱（Allium fistulosum L.）为百合科葱属植物，杂交优势强，利用大葱雄性不育生产杂交种是必不可少的途径之一。本项目重点研究了大葱N型细胞质特异标记开发；采用TAIL-PCR的方法，得到大葱atp6基因序列全长；通过Real-time PCR 进行mRNA差异表达分析，研究了atp6基因在不同生长发育阶段的表达情况；利用基因互补验证的方法将A-atp6基因转入不育系大葱愈伤组织。具体实验结果如下：.1）大葱N型细胞质特异标记开发。开发了大葱S/N特异SCAR标记、dCAPS标记及KASP标记，这些标记均在不同的来源遗传背景材料中进行了验证， PCR结果与遗传分析结果一致，说明了标记的有效性。.2）根据GenBank数据库中大葱atp6 假基因序列(GenBank Accession No.JQ283733.1)，设计引物获得atp6 基因序列，然后根据TAIL-PCR获得atp6基因全长。不育系具有T- atp6（GenBank No. KR973431），可育系具有A- atp6（GenBank No. KR973430）。我们对所获得的两种基因型与atp6 假基因序列(GenBank Accession No.JQ283733.1)进行了比较。发现在170位置比JQ283733.1序列多了一个T碱基，从而使不能编码氨基酸的JQ283733.1变成了一个完整的atp6基因，在194位有一个G/T的碱基差异。不育细胞质与可育细胞质在171位有一个A/T的碱基差异。.3）大葱野生型与突变型atp6基因的差异表达分析。提取了大葱不育系和保持系不同生长发育阶段和组织材料的总RNA，反转录成cDNA，进行了不育系和保持系之间的差异表达研究。结果表明不育系大葱开花期根系atp6基因表达是可育株的0.878倍，花的表达差异不大。.4）大葱野生型与突变型atp6基因功能互补验证研究。构建了大葱A-atp6基因表达载体Ubi-1：：cox4 presequence - A-atp6，其中cox4 presequence为线粒体靶向肽。用包含有目的基因A-atp6的农杆菌侵染大葱愈伤组织。利用潮霉素抗性基因序列设计引物检测转化效率，所有检测样品均显示A-atp6基因已经成功转入大葱愈伤组织。.本项目开发的分子标记可以对大葱细胞质育性进行快速准确的判断，提高大葱保持系选