三氯吡啶酚厌氧降解途径及关键微生物群落研究

3,5,6-trichloro-2-pyridinol (TCP) is the major hydrolysis metabolite of chlorpyrifos by both hydrolysis and photolysis. It is more mobile in soil and more leachable into groundwater and surface water, which causes the widespread contamination in soils and in the aquatic environment due to mass production and excessive use of chlorpyrifos in our country. Biodegradation of TCP is a key technical challenge in elimination of chlorpyrifos residues. Compared with aerobic environments, TCP persisted longer in the anaerobic streams and sediments. The anaerobic degradation pathway of TCP and its key microbial communities have remained poorly understood. In the present study, we collected soil and sludge samples from TCP polluted environments and enriched the stable methanogenic cultures of TCP. The anaerobic degradation pathway of TCP was determined by analyzing hydrolysis metabolites. DNA stable isotope probe (DNA-SIP) combined terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) and bacterial and archaeal 16S rRNA genes clone libraries were used to detect the key microbes involved in methanogenic degradation of TCP in anaerobic soil and sludge.

有机磷农药毒死蜱在我国的大量生产和超量使用，加之其高毒难降解的残留物三氯吡啶酚（TCP）在土壤中较强的迁移能力和可浸入地下及地表水的性质，导致TCP的环境污染日趋严重。因此，TCP生物降解技术已成为目前消除毒死蜱残留的关键技术挑战。在厌氧生境中，TCP的残留期要长于好氧生境，但其厌氧降解的途径及关键微生物群落并不清楚，这直接阻碍了TCP厌氧降解机理的研究。本研究从TCP污染的土壤和污泥中采样，以TCP为唯一碳源，富集稳定的TCP厌氧降解产甲烷培养物，采用液相色谱结合稳定性同位素质谱技术（LC-IRMS）分析TCP的厌氧降解产物，揭示其厌氧降解途径；通过DNA稳定同位素探针（DNA-SIP）、细菌和古菌16S rRNA基因的T-RFLP 和克隆文库等技术，阐明厌氧降解TCP的关键微生物群落结构。从而为TCP厌氧降解菌的分离提供指导，为深入开展TCP厌氧降解机理研究奠定微生物学基础。

有机磷农药毒死蜱在我国的大量生产和超量使用，加之其高毒难降解的残留物3，5，6-三氯-2-吡啶酚（3,5,6-trichloro pyridine-2-phenol, TCP）在土壤中较强的迁移能力和可浸入地下及地表水的性质，导致TCP的环境污染日趋严重。微生物降解TCP是消除TCP残留的有效途径。然而在厌氧生境中，TCP的残留期要长于好氧生境，但其厌氧降解途径及关键微生物群落并不清楚，这直接阻碍了TCP厌氧降解机理的研究。本项目以TCP为目标污染物，通过厌氧操作技术富集稳定的TCP厌氧代谢菌群；采用气相色谱、液相色谱、液质联用等技术分析TCP的厌氧降解产物，揭示其厌氧降解途径；并通过高通量测序技术阐明厌氧降解TCP的关键微生物群落结构。从而为深入解析TCP的厌氧降解机制奠定微生物学基础。 结果表明（1）以长期受毒死蜱及TCP污染的土壤样品为接种源，以TCP为唯一添加碳源，厌氧富集培养12个月后，获得了稳定的TCP厌氧降解富集培养物。（2）在厌氧条件下，TCP的降解是一种混合的代谢途径。TCP主要通过微生物降解，同时伴随着少量的光解。微生物对TCP的厌氧降解主要通过还原脱氯、水解脱氯的方式完成。在TCP降解初期，TCP依次还原脱氯为5,6二氯二吡啶醇，6-氯二吡啶醇；然后通过水解脱氯等方式转变为2,5-二羟基嘧啶或2,3-二羟基嘧啶，随后吡啶环断裂转变为马来酰胺酸，延胡索酸等，最终转化为CO2和H2O，从而实现TCP的完全降解。（3）变形菌门(Proteobacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，放线菌门(Actinobacteria) 是TCP厌氧菌群的主要细菌类群。苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)，代尔夫特菌属(Delftia sp.)，寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)，杆菌属(Bacillus sp.) 等是TCP厌氧菌群的优势细菌，其中脱氯菌和TCP降解菌共同参与了TCP的还原脱氯降解过程，从而使得整个菌群对异源化合物TCP的代谢能力大大提高。通过以上研究，本项目获得了稳定的TCP厌氧降解菌群，揭示了菌群对TCP的厌氧代谢途径并阐明了TCP厌氧降解菌群的关键微生物群落结构及关键微生物，这为深入解析TCP的厌氧降解机制，研发高效的TCP污染物脱毒技术提供了重要的科学依据。