肝细胞内质网应激对Insig-SCAP-SREBPs脂质代谢途径的影响

Insig-SCAP-SREBPs是肝细胞重要的脂质代谢途径，调控肝细胞内游离脂肪酸、甘油三酯及胆固醇的合成。Insig及SCAP蛋白分布于内质网膜上且内质网应激可使SREBPs转录水平增加，因此，我们推测内质网应激是导致肝细胞脂质代谢失平衡的重要因素。本研究拟通过体外诱导小鼠肝细胞产生内质网应激，考察此状态下肝细胞脂质合成水平，并通过siRNA敲除Insig及SCAP，构建SREBPs不同功能域融合蛋白表达质粒以及免疫共沉淀CHIP-chip等手段，分析内质网应激对Insig-SCAP-SREBPs质代谢途径的影响及意义，以期探明非酒精性脂肪性肝病肝细胞脂质沉积的机制，为人工干预肝细胞脂质沉积积极防治非酒精性脂肪肝找到新的途径。

背景与目的：探讨肝细胞脂肪变性状态下诱导产生内质网应激以及由此导致甘油三酯合成增加脂变加重的损伤及机制。方法：以肝细胞L02及HepG2细胞系为实验对象，用软脂酸钠诱导其产生脂变，用毒胡萝卜素（TG）诱导其产生内质网应激，通过检测内质网应激有关反应、甘油三酯合成情况以及有关细胞信号转导分子活化水平，研究肝细胞脂变后内质网应激产生的机制以及内质网应激产生后诱导肝细胞甘油三酯合成增加肝细胞损伤加重的机制。结果：1、用软脂酸钠成功诱导建立肝细胞株脂肪变性模型，油红“o”染色可见大量橘红色脂滴在肝细胞内聚集，培养上清的转氨酶（ALT、AST）水平及脂质过氧化（GSSG、MDA）水平明显升高，MTT及凋亡率检测证实细胞活性下降凋亡增加，还原型谷胱甘肽干预后相应指标呈显著下降趋势（P<0.05）。2、内质网应激信号及通路研究发现，软脂酸诱导肝细胞脂变后GRP78蛋白水平明显增加，p-PERK水平在软脂酸钠处理12小时后开始升高，24小时达到高峰，ATF4 mRNA表达在软脂酸钠作用后2小时开始上调，12小时达到高峰，20小时以后开始下降，ATF4蛋白水平在24小时有所增加，与正常对照比较差异有统计学意义。GSH干预后，GRP78蛋白、p-PERK水平、ATF4 mRNA及蛋白水平均明显下降，证实内质网应激由脂质过氧化诱导。3、用TG成功建立肝细胞内质网应激模型，在该模型中检测到甘油三酯合成增加，油红染色机电镜等检测证实细胞发生脂变；4、对SREBPs及其下游脂质合成基因的检测证实内质网应激状态下肝细胞脂质合成增加由SREBP-1c介导，沉默其表达或者阻断其活化的S1P酶可以减轻肝细胞脂变；5、对SREBP-1c上游细胞信号通路检测显示，其激活主要由Insig/SCAP介导，肝X受体途径并未有参与该机制。.结论：1、脂肪酸在肝细胞内过量蓄积可以导致细胞发生脂肪变性，然后通过脂质过氧化诱导细胞发生内质网应激，产生细胞损伤；2、肝细胞内质网应激一旦产生后，通过促进SREBP-1c的表达和活化促进肝细胞内甘油三酯合成增加，细胞损伤进一步加重；3、通过抑制SREBP-1c活化所需S1P或者上游Insig/SCAP信号通路，能够为减轻肝细胞脂变损伤提供新的靶点。