Ly6Chi巨噬细胞通过分泌颗粒体蛋白活化HSCs促进肝纤维化进程的研究

Almost none effective anti-fibrotics for liver fibrosis has entered clinical practice. Immune responses have been demonstrated to play an important role in the pathogenesis of liver fibrosis. Our previous studies showed that monocyte-derived Ly6Chi macrophages increase significantly in fibrotic liver tissues of mice and exert profibrotic functions in liver fibrosis progression. However, the mechanism has not yet fully been elucidated. Recent studies have demonstrated that granulin (GRN) secretion by metastasis-associated macrophages activates hepatic stellate cells (HSCs) into myofibroblasts that secrete periostin (PN), resulting in the microenvironment that sustains metastatic tumor growth. PN has been reported to promote fibrosis. Our primary studies have shown that the GRN, PN and Col1a expression is significantly increased in the liver tissues of fibrotic mice. It is reported that GRN can regulate downstream target genes through STAT3 signaling pathway. By bioinformatics analysis, we found a STAT3 binding site in the PN promoter region. We speculate that upon liver injury, Ly6Chi macrophages may secrete a large amount of GRN to promote the secretion of PN in HSCs through STAT3 signaling pathway. The secreted PN may stimulate HSCs to produce Col1a1, which promotes liver fibrosis. In this study, a series of experiments, including chromatin immunoprecipitation, flow cytometer sorting and animal experiments will be carried out to reveal the novel mechanism of Ly6Chi macrophages promoting liver fibrosis. Our study may provide potential targets for anti-hepatic fibrosis therapy.

肝纤维化缺乏直接有效的治疗手段，其免疫发病机制逐渐受到重视。我们前期研究显示单核细胞来源的Ly6Chi巨噬细胞在纤维化肝组织中明显增多，能促进肝纤维化进程，但其机制仍不明。最新研究报道肿瘤转移相关巨噬细胞能通过分泌GRN活化HSCs，促进其分泌PN介导胰腺癌肝转移，而已知PN能促进肝纤维化。我们研究证实肝纤维化小鼠肝组织中GRN、PN及Col1a1表达明显增高。文献报道GRN可通过STAT3信号通路调控下游靶基因。我们通过生物信息学分析发现PN启动子区存在STAT3结合位点。我们推测：肝组织损伤时，组织中Ly6Chi巨噬细胞会释放大量GRN通过STAT3通路促进HSCs分泌PN，而PN能刺激HSCs大量产生Col1a1，促进肝纤维化的进程。为验证上述假说，我们拟采用染色质免疫共沉淀、流式细胞分选术和动物实验等方法揭示Ly6Chi巨噬细胞促进肝纤维化的新机制，为寻找抗肝纤维化新靶点提供思路。

单核细胞来源的Ly6Chi巨噬细胞参与促肝纤维化的发生，但其机制仍不明确。研究发现肿瘤转移相关巨噬细胞能通过分泌颗粒体蛋白（GRN）活化肝星状细胞（HSCs），促进其分泌骨膜蛋白（PN）介导胰腺癌肝转移。我们基于前期研究及文献报道推测肝组织损伤时，肝组织中Ly6Chi巨噬细胞会释放大量GRN通过STAT3通路促进HSCs分泌PN，而PN能刺激HSCs大量产生Col1a1，促进肝纤维化的进程。为验证该假说，我们检测慢性肝病（CLD）患者肝组织中GRN的表达，揭示其与肝脏炎症、纤维化以及肝脏临床指标之间的关系；建立小鼠肝纤维化模型，观察肝纤维化过程中GRN的动态变化；观察GRN敲除后对小鼠肝纤维化的影响，并通过GRN与肝星状细胞LX-2共培养，观察GRN对LX-2的活化作用；探讨肝纤维化过程中GRN的主要分泌细胞；观察肝纤维化小鼠肝脏中库否细胞（KCs）和单核细胞动态变化，以及单核细胞趋化因子的变化，并利用CCR2-/-小鼠观察抑制单核细胞浸润后肝脏中GRN的表达变化；利用骨髓细胞GRN缺陷小鼠和骨髓细胞GRN正常表达小鼠，观察单核细胞分泌的GRN对小鼠肝纤维化的作用；利用GRN-/-小鼠和野生型小鼠骨髓单核细胞培养上清分别与HSCs共培养，观察Col1a1和α-SMA表达变化。研究结果显示：CLD患者肝组织中GRN+细胞数量明显增加，与肝脏炎症、纤维化程度，及ALT水平呈正相关；小鼠肝纤维化模型中，随着肝脏炎症和纤维化程度增加，肝组织中GRN表达增加；GRN通过促进HSCs活化而促进肝纤维化发生；肝纤维化过程中，GRN主要由单核细胞来源的巨噬细胞分泌，其主要通过STAT3通路促进肝纤维化的发生；CLD患者肝组织中单核/巨噬细胞数量明显增加，但在肝纤维化过程中，KCs数量并无明显变化；CCR2-/-小鼠肝纤维化造模后，单核细胞肝组织浸润显著减少，同时GRN表达降低且肝纤维化程度也减轻。本研究阐明单核细胞来源的巨噬细胞通过分泌GRN促进肝纤维化的机制，但GRN敲除后肝纤维化小鼠PN表达无明显变化，提示GRN可能不是通过调控PN促进肝纤维化的发生。本研究提示GRN可作为肝纤维化潜在的治疗靶点，为抗肝纤维化的治疗提供新的思路。