14-3-3η/bcl2交互作用在抗急性心肌损伤中的意义

前人和本课题组前期工作已证实Bcl2和14-3-3η均能参与心肌IPC保护作用，机制与关闭mPTP有关。我们假设其内源性保护作用并不是"孤立"的，而是其间交互作用的结果。我们围绕 "14-3-3η-Bcl2复合体形成→14-3-3η-Bcl2复合体线粒体膜亚定位→线粒体功能改变→14-3-3η-Bcl2复合体作用终止"主线，拟采用腺病毒表达载体构建及其转染技术，构建相应的转基因心肌细胞；采用酵母双杂交、Co-IP 、GST-Pulldown等方法确认在IPC/I-postC中存在14-3-3η和Bcl2的交互作用，探讨其复合体的线粒体膜亚定位及与mPTP/VDAC1相互关系、对线粒体功能的影响；并初步探讨其复合体作用终止方式；最后在整体动物实验上进行比较确认。本研究将进一步完善IPC/I-postC保护作用中对14-3-3η信号路径的认识，为发现新的药物作用靶点奠定良好的理论与实验基础。

前期工作已证实Bcl2和14-3-3η均能参与心肌IPC保护作用，机制与关闭mPTP有关。我们假设其保护作用并不是“孤立”的，而是其间交互作用的结果。围绕 “14-3-3η-Bcl2复合体形成→复合体线粒体膜亚定位→线粒体功能改变→复合体作用终止”主线，本项目完成了腺病毒载体pAD/Bcl2、pAD/14-3-3η和pAD/Flag-14-3-3η、pAD/sh14-3-3η的构建、病毒滴度测定及转染细胞相应蛋白水平的测定；应用酵母双杂交技术证实14-3-3η与Bcl2间存在交互作用。而在原代培养大鼠乳鼠心肌细胞IPC/I-postC中14-3-3η和Bcl2交互作用确认实验中：共转染pAD/Bcl2、pAD/14-3-3η并经A/R损伤或是IPC/I-postC保护处理后，培养液中LDH、CPK活性均显著降低，细胞存活率增加，凋亡减少； GST- pulldown与CO-IP实验确认14-3-3η与Bcl2间存在交互作用；当共转染pAD/Bcl2、pAD/sh14-3-3η后，实验结果则反之。采用双、多标记免疫荧光法和Confocal法等方法确认了14-3-3η/Bcl2复合体与线粒体mPTP/ VDAC1间的交互作用；采用激酶磷酸化试剂盒检测发现Bcl2 S368磷酸化在心肌保护中发挥着重要作用；测定线粒体膜电位（ΔΦm）、ROS和游离钙含量、细胞凋亡，测定细胞线粒体肿胀以及细胞色素C含量等研究了14-3-3η/Bcl2复合体线粒体膜亚定位对线粒体功能的影响；探讨了复合体作用终止方式及其分子机制。完成了整体大鼠验证实验：14-3-3η蛋白过表达可模拟IPC/I-post C对抗缺血/再灌损伤，表现为改善左心收缩功能及心肌酶谱、减少心律失常发生率以及心肌梗塞面积等系列心肌保护作用；而14-3-3η蛋白低表达则反之。本项目还完成了部分中药有效成分对Bcl2表达影响的研究，首次发现芹菜素、黄芪甲苷等可不同程度上调原代培养的大鼠心肌细胞Bcl2的表达，提高其对抗缺氧/复氧损伤的能力。本研究将进一步完善IPC/I-postC保护作用中对14-3-3η信号路径的认识，为发现新的药物作用靶点奠定良好的理论与实验基础。本课题全面完成研究计划，发表学术论文9篇（标注资助），并培养博士生2名，硕士生4名。