泽兰水提物抑制TGF-β1信号保护糖尿病肾病足细胞损伤的机制研究

Diabetic nephropathy (DN) is one of the main causes of end stage renal disease, and podocytes injury is the key factor in the process of DN proteinuria and glomerular sclerosis. Our previous studies found that the aqueous extract of Lycopus lucidus Turcz can ameliorate streptozotocin-induced diabetic renal damage, induce proteinuria; in vitro, Lycopus lucidus could inhibit TGF-β1 pathway of mouse mesangial cells. Studies have confirmed that the TGF- beta 1 signaling pathway plays an important role in the podocytes injury of DN. Based on the above, we put forward hypothesis Lycopus can protect podocytes injury in diabetic nephropathy via inhibiting TGF- beta 1 signaling. This paper intends to use STZ to induce diabetic nephropathy rats model, from the point of view of protecting podocytes, confirm the curative effect to DN. With electron microscopy and Western Bolting, RT-PCR, immunohistochemistry methods, we observe foot cells ultrastructure, protein expression of podocytes hypertrophy, apoptosis, epithelial-mesenchymal transition. We prepare podocytes express different levels of TβRⅡ, explain that Lycopus protect podocytes dependent on selective downregulation of TβRⅡ and inhibition of TGF beta1 signal, deeply study the mechanism of Lycopus protecting DN podocytes injury.

糖尿病肾病（DN）是终末期肾病的主要原因之一，足细胞损伤是DN蛋白尿及肾小球硬化过程的关键因素。我们前期研究发现泽兰能够减少DN大鼠蛋白尿，缓解肾损伤；在体外，泽兰能抑制小鼠系膜细胞TGF-β1信号通路。研究证实TGF-β1信号通路在DN足细胞损伤中扮演重要角色。基于以上，我们提出泽兰水提物可抑制TGF-β1信号保护DN足细胞损伤的假说。本课题拟采用STZ诱导的DN大鼠模型，从足细胞保护角度证实泽兰水提物的治疗作用，通过电镜、Western Bolting、RT-PCR、免疫组化等方法观察足细胞超微结构及足细胞肥大、凋亡、EMT相关蛋白的表达变化，采取基因转染技术制备TβRⅡ不同表达状况的足细胞亚系，阐释泽兰水提物保护足细胞的作用依赖于选择性下调TβRⅡ，抑制TGF-β1信号，系统深入地探讨泽兰保护DN足细胞损伤的机制。

足细胞损伤是DN蛋白尿及肾小球硬化过程的关键因素，TGF-β1信号通路在DN发生发展中起到关键性作用。我们通过体内动物实验，链脲佐菌素（STZ）建立T2D大鼠模型，以及泽兰高中低剂量及氯沙坦钾灌胃干预，检测血尿生化指标，ELISA方法检测各组血清TGF-β1水平，肾组织病理学观察及电镜足细胞超微结构观察。Western blot、免疫组化技术监测足细胞标志蛋白（nephrin）、TGFβ1信号（TGF-β1, TβRⅡ，P-SMAD2/3，SMAD2/3，SMAD4， p-ERK1/2，ERK1/2，p-p38，p38）、肾皮质 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白 p21 Cip1/waf1 和 p27 Kip1、细胞凋亡相关基因 cleaved caspase-3、bax 、BCL2蛋白、α3β1 整合素的表达变化。体外细胞实验，以泽兰高中低剂量及氯沙坦钾灌胃后提取备制含药血清，ELISA方法检测各组细胞上清TGF-β1水平，然后高糖刺激大鼠足细胞后予含药血清分组共培养48h。分别通过慢病毒法构建干扰型TβRⅡ细胞株，将pLVX-IRES-ZsGreen1(空载体），pLVX-IRES-ZsGreen1-TβRⅡ（TβRⅡ质粒）分别和辅助质粒pMD2G和psPAX，转染大鼠肾小球足细胞制备稳定过表达TβRⅡ细胞株及对照组细胞，予TGF-β1干预后培养24小时，WB检测各组TGF-β1, TβRⅡ，P-SMAD2/3，SMAD2/3，SMAD4，p-ERK1/2，ERK1/2，p-p38，p38，Nephrin、足细胞药物干预前后肾皮质细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白 p21 Cip1 和 p27 Kip1、细胞凋亡相关基因 cleaved caspase-3、bax 、BCL2蛋白、α3β1 整合素的表达变化。 结果证实泽兰水提物可抑制TGF-β1诱导的P38 和ERK1/2的磷酸化，对TβRⅡ基因过表达的足细胞具有下调作用，进而通过调节TGF-β /Smad和MAPK信号通路，达到对糖尿病肾病足细胞的保护作用的目的。也初步证实了泽兰水提物可以通过抑制cleaved caspase-3、bax 、促进BCL2表达，减少凋亡保护足细胞。但是同时泽兰对α3β1抑制，且对足细胞骨架相关蛋白p21 Cip1 和 p27 Kip1反而有促进作用，其意义有待进一步研究及解释.