Notch信号调控ROS在严重烧伤中的心肌保护作用及机制研究

Excessive generation of reactive oxygen species (ROS) and the subsequent oxidative damage during the myocardial ischemia and hypoxia process is the major pathophysiological basis, which is still lack of effective treatment measures. Studies confirmed that Notch signaling pathway can regulate ROS generation through Hes-STAT3-MnSOD axis, thus achieving protection to organs subjected to ischemia and hypoxia conditions. Our previous studies have also suggested that activation of the Notch signaling pathway can reduce ROS levels of myocardial cell in burn model, thus reducing the injury degree. Whether this effect was caused through the Hes1-STAT3-MnSOD axis need urgent investigation. Therefore, in this study we intend to assess changes of Notch signaling molecules and the molecules of Hes1, JAK2/STAT3, MnSOD, ROS of myocardial cell stimulated by burn serum or from burn mice. Furthermore, adenovirus will be introduced by the molecular biological methods, to stimulate or interfere the key molecule Hes1, molecule and myocardial effects mentioned above will also be observed. By all this, the molecular mechanisms of "Hes1- STAT3-MnSOD" axis will be disclosed in the process that Notch signaling pathway on ROS regulation, which will provide new ideas for prevention and treatment of burns of early myocardial damage.

活性氧（ROS）所致氧化损伤是烧伤后心肌损伤的主要病理生理基础，尚缺乏有效的防治措施。研究证实Notch信号途径可通过 Hes-STAT3-MnSOD轴调控ROS生成从而实现对缺血缺氧脏器的保护。我们前期研究也提示：激活Notch信号途径可以降低烧伤模型心肌细胞ROS水平，减轻心肌细胞损伤，这一作用是否通过"Notch-Hes1-STAT3-MnSOD"途径对ROS调控实现，有待验证。因此本研究拟检测烧伤血清刺激后心肌细胞及小鼠烫伤后Notch信号分子及Hes1、JAK2/STAT3、MnSOD、ROS等分子的变化。进一步通过腺病毒等分子生物学方法激活或干扰关键分子Hes1，观察上述分子的变化及心肌细胞效应，明确"Notch-Hes1-STAT3-MnSOD"在Notch信号途径对ROS调控的分子机制及调控的关键位点，为防治烧伤早期心肌损伤提供新思路。

严重烧伤早期由于心肌细胞损害和心功能不全，给抗休克复苏治疗带来很大困难，一方面需要大量补液来维持有效的组织灌流量，而另一方面是大量补液增加心肌负荷，进一步加重心肌损害，进而导致休克加重，最终影响了严重烧伤患者的成功救治。因此，如何减轻心肌的损伤和保护心肌细胞是成功救治严重烧伤的关键性环节之一。但严重烧伤早期心肌损伤的分子机制还不十分清楚，前期我们研究显示，细胞内活性氧簇ROS与心肌损伤密切相关。新近研究表明，Notch信号途径在细胞的缺血损伤中具有重要保护作用，激活Notch信号途径可抑制细胞内ROS生成，降低细胞死亡率。那么，严重烧伤早期Notch是否参与心肌损伤，是否通过调控ROS的生成来实现尚不明确。为此，我们利用小鼠烫伤模型以及细胞烧伤血清刺激实验研究，首先，检测证实了Notch信号参与了烧伤后心肌损伤；其次，使用GSI阻断Notch信号后经烧伤血清刺激心肌细胞，流式细胞仪检测细胞内ROS水平；AO/EB检测细胞凋亡，同时检测上清中LDH水平，结果显示，阻断Notch信号后，细胞内ROS水平明显增加，细胞凋亡增加同时LDH水平明显升高，细胞损伤；利用Notch信号下游RBP-J敲除小鼠，烫伤模型检测血清中CK,CK-MB以及LDH的水平；TUNEL检测心肌细胞，结果显示，RBP-J敲除小鼠烧伤后CK,CK-MB以及LDH的水平明显增加，且细胞凋亡增加。同时阻断Notch信号，增加ROS的产生水平以及烧伤后心肌超氧阴离子。发现阻断Notch后经烧伤血清刺激，心肌细胞内ROS水平明显增加，同时敲除鼠的细胞内超氧阴离子明显增加，说明烧伤后诱导产生大量ROS。最后，使用抗氧化剂NAC清除ROS后，AO/EB染色结果显示细胞凋亡明显减少，细胞上清中LDH生成减少，ROS在心肌损伤中发挥重要作用。通过Western检测p-JAK/JAK;p-STAT3/STAT3及MnSOD的蛋白表达对其机制探讨发现：阻断Notch信号后，组织和细胞中MnSOD的蛋白表达减少； JAK2/STAT3的蛋白表达以及p-JAK和p-STAT3的蛋白水平降低。提示Notch信号通过Hes1-STAT3-ROS分子调控轴起保护性作用，将有可能解释烧伤早期心肌损害的分子机制，发现调控心肌细胞ROS生成与清除的关键位点，为防治烧伤早期心肌损伤提供新的治疗策略。