生物化修饰构建成骨细胞特异性识别牙种植体表面的研究

本项目旨在钛种植体表面构建成骨细胞特异性识别的多肽表面，改善其生物相容性，促进种植体周骨创愈合。研究依据材料表面生物化修饰理论，首先应用噬菌体展示技术，筛选出与成骨细胞具有高度亲和性的特异性识别的噬菌体，对其进行DNA测序，推导此多肽适配子的氨基酸序列，并采用固相合成技术合成此多肽适配子，在其氨基端接枝生物素，形成生物素衍生物。然后用有机膦酸-3-氨丙膦酸处理钛表面，膦酸头部与氧化钛形成化学键合，"尾部基团"氨基游离于钛表面，在钛表面获得化学键合的氨基；再通过水溶性碳二亚胺（EDC）作为催化剂活化亲和素的羧基，与钛表面的氨基反应形成肽键，将亲和素蛋白共价接枝在钛表面；最后通过亲和素与生物素的识别作用，形成近似共价键的结合，将生物素化的多肽适配子固定在钛表面，赋予钛表面具有特异性识别成骨细胞的"分子手臂"。进一步通过体外、体内的生物学研究评价其生物学效应。为钛种植表面的生物化修饰提供新策略。

结题摘要. 钛种植体表面的生物化改性是近年来该领域的研究热点，据此，本课题依据材料表面生物化修饰理论，采用噬菌体展示技术，在钛种植体表面构建成骨细胞特异性识别的多肽结构，以改善其生物相容性，促进种植体周骨创愈合。研究具体内容如下。.第一部分：研究首先通过噬菌体展示肽库筛选技术，一方面，以人颅骨成骨细胞作为靶细胞，对噬菌体展示十二肽库进行全细胞筛选获得噬菌体克隆，再以人牙龈成纤维细胞为对照细胞进行阳性噬菌体克隆的鉴定及测序分析，出现频率最高的目的多肽氨基酸序列为：M G W S W W P E T W P M。另一方面，以人颅骨成骨细胞作为阳性靶细胞，人牙龈成纤维细胞为阴性吸附细胞，对噬菌体展示十二肽库进行全细胞差减筛选，获得与成骨细胞特异性高结合力的目的多肽，其氨基酸序列为V L A V P W S E P G Y L。再对上述多肽序列的氨基酸组成特点及其基本的生化特性进行了分析。第二部分：研究通过化学方法，选取合成成骨细胞特异性识别多肽（氨基酸序列为：V L A V P W S E P G Y L），通过共价键合将其固定在钛基材表面，并对其进行体外细胞学评价。实验结果证实：该多肽分子成功地接枝到钛基材表面，体外细胞学实验亦进一步证实该特异性识别钛基材表面可以显著促进人成骨细胞的增殖、矿化。第三部分：研究仍选取全细胞差减筛选所得的人成骨细胞特异性识别多肽（氨基酸序列为：V L A V P W S E P G Y L），通过体外细胞学实验来检测该特异性多肽在促进成骨方面的生物学性能，分别从细胞增殖实验、成骨细胞增殖早期碱性磷酸酶（ALP）的表达、细胞茜素红染色以及骨钙素（OCN）mRNA的表达几方面进行研究，结果显示一定浓度的特异性识别多肽在成骨细胞生长各阶段对其骨形成的生物学功能皆具有促进作用。第四部分：研究依据组织工程学原理，采用天然多糖的壳聚糖/海藻酸钠复合水凝胶作为支架材料，以前述成骨细胞特异性识别多肽（氨基酸序列为：V L A V P W S E P G Y L）作为信号因子，将二者复合后植入兔颅骨极限缺损动物模型体内，并通过一系列检测方法以观察其体内成骨效应。目前，该部分实验的前期结果已证实：该特异性多肽分子能够在动物体内明显促进骨缺损的修复重建。.本课题截止目前，其研究成果已发表相关论文6篇，1篇中文核心期刊论文已接收待发表。