基于二维LC-MS和活性分析整合策略从海洋放线菌中发现抗真菌活性新化合物的研究

In recent years, due to various thereapic and diseases as well as the formation of drug resistance in pathogenic microbes, The morbidity and mortality from fungal infections have a continuous increase. So, To discover new sort of antifugal drugs is the contineous and urgent needs in medical and pharmatheutical fields. Secondary metabolites from marine actinomycetes are one of the important sources for antifungal drugs. Marine actinomycetes from mangrove zone are a new source to be exploite for the research on the discovery of antifungal drugs. In our previous reseach, we have screened out 27 strains of actinomycetes with producing antifungal secondary metabolites from more than two thousand strains of actinomycetes which are isolated from mangrove zones in south China sea and own by ourself. We have done some investigations on the antifungal secondary metabolites of five bioactive strains, and isolated and identified a series of antifungal compounds， including some new compounds. In this project, we will use Candida albican as the indicator, use a few different fermentation methods for the culture of active strains, and integrete the technique and means of 2D HPLC-MS analysis， antifungal actitity-guidance, high resolution Mass spectra analysis and data crossmatching, molecular genetic identification on 16S rDNA analysis for strains, search with Scifinder and other databases to speed up the identification of active compounds from the bioactive fermentation broth of actinomycetes, discover the new antifungal active compounds, and evaluate the activities of new compounds against various pathogenic fungi。 This project will built the research base for the discovery of antifungal leads and the producing strains of bioactive substances, and is of important significance for the research of antifungal drugs.

近年来，由于种种医疗和疾病原因，以及病原菌耐药性的产生，真菌感染的发生率和死亡率都在不断上升。因此，发现新型抗真菌药物是医药卫生领域持续而又迫切的需要。放线菌次生代谢产物是抗真菌药物的重要来源之一, 红树林来源海洋放线菌是一个有待深入进行抗真菌药物发现研究的新资源。在前期研究中，我们从我国南海红树林区域来源的独自享有的两千余株海洋放线菌中筛选出了45株抗真菌活性菌株，对其中几个活性菌株的研究也已分离鉴定了系列活性化合物。本研究拟以白色念株菌为指示菌，采用多种培养方法进行菌株发酵，和整合2D HPLC-MS、抗真菌活性分析、高分辩质谱分析、菌株种属信息和微生物代谢物数据库搜索、层析分离、光谱鉴定等技术手段，加快从所筛选的活性菌株发酵物中鉴定活性化合物，发现活性新化合物，并对新化合物进行抗真菌活性评价，为抗真菌药物先导物及活性物质产生菌发现奠定研究基础，对抗真菌新药研究具有重要意义。

海洋来源微生物是一个独特的生物资源，具有产生独特的活性次生代谢产物乃至药物的能力和潜力。开展对海洋来源放线菌及其代谢产物研究，对于抗真菌。抗肿瘤作用药物和先导物发现意义重大。本项目分别对10株放线菌进行菌种分类鉴定研究、对其中6株进行了发酵条件的优化、放大培养及其发酵产物中的化学成分及其抗白色念株菌和抗肿瘤细胞增殖的生物活性研究。主要结果如下：（1）通过形态特征、培养特征、生理生化特性和16s rDNA序列分析分别对6株放线菌菌株进行了分类鉴定，结果鉴定5株放线菌株为抗生链霉菌（Streptomyces antibioticus），一株为阿南德氏链霉菌（Sreptomyces anandii）。（2）综合采用ODS开放柱、Sephadex LH20 柱层析及半制备HPLC和二维色谱等色谱学分离手段，对6株放线菌株抗白色念株菌活性发酵产物的乙酸乙酯萃取部位进行了较系统的化学成分分离和纯化。通过谱学方法，并结合计算CD方法，共鉴定了82个单体化合物的结构，其中包括14个新化合物。化合物类型包括抗霉素类24个、甾体类29个、放线菌素类2个、环缩肽类7个及其他类20个。（3）对分离得到的化合物进行了抗白色念珠菌活性和多瘤株细胞毒活性的测试，发现抗霉素类化合物均具有一定的抗白色念珠菌活性和细胞毒活性，放线菌素类化合物具有较弱的抗白色念珠菌活性而具有较强的细胞毒活性，其IC50值小于1.6 μg/mL。其中具有较强抗真菌活性的化合物20个，具有较强抗肿瘤活性的化合物33个。（4）发现了5株产生抗霉素的放线菌菌株，并发现三株菌株具有强力且同时产生抗霉素、放线菌素X2和D的能力，一株还同时产生抗真菌活性多烯的能力，因此具有进一步诱变成工程菌的潜质。此外，2株菌株具有产生新型抗霉素的能力和潜力，值得深入研究。（5）本项目基金共发表论文数14篇，其中包括SCI论文6篇、其它英文期刊论文3篇、中文核心期刊论文5篇和会议论文3篇，申请发明专利一项。此外，共培养硕士研究生6名，本科生5名, 产生了硕士学位论文6篇和本科学士论文5篇。本项目研究丰富了我国近海来源海洋放线菌的菌株与活性次生代谢产物研究内容，发现了可进行发酵生产抗霉素类化合物的潜在工程菌，发表了一些具有一定学术影响力的论文。此外，通过本项目研究培养了多名具有从事微生物培养与代谢产物研究能力的硕士毕业生。