靶向抑制TMEM16A保护缺血性卒中后血脑屏障完整性及机制研究

Inflammatory reaction plays a pivotal role in the blood-brain barrier (BBB) destruction following ischemic brain injury. Enhanced leukocyte adhesion to vascular endothelial cell is an essential event in inflammatory process. TMEM16A, a newly discovered protein regulating the calcium-activated chloride channels (CaCCs), is widely expressed in eukaryotes. Recently, some researches have suggested that TMEM16A is associated with inflammation. What’s more, our preliminary results demonstrated that TMEM16A was expressed in vascular endothelial cells of mouse brain and TMEM16A was up-regulated after middle cerebral artery occlusion (MCAO) in mice. With the application of TMEM16A inhibitor, infarct volume was significantly decreased and the permeability of BBB was also rescued in MCAO models. Likewise, in cultured endothelial cells, TMEM16A inhibitor profoundly downregulated the expression levels of adhesion molecules after the LPS and TNF-α stimulation. Therefore, in this project, using TMEM16A conditional knock-out mice and biological techniques, we aim to further confirm that targeted inhibition of TMEM16A exerts protective effects on BBB integrity following ischemic brain injury and to explore the potential molecular mechanisms. In conclusion, this research may provide a novel clinical treatment combating BBB destruction in ischemic stroke.

炎症反应是造成缺血性卒中后血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）结构和功能破坏的重要原因，引起炎症反应的关键因素是白细胞与血管内皮细胞的粘附、外渗。TMEM16A蛋白是新发现的钙离子激活Cl-通道的分子基础，在真核生物组织广泛表达，与炎症反应有关。我们前期研究发现，小鼠脑血管内皮细胞中表达TMEM16A，一侧大脑中动脉栓塞小鼠模型梗死侧皮层的TMEM16A表达增高，而TMEM16A抑制剂可显著减少缺血性卒中小鼠的梗死体积、减少血脑屏障破坏；体外炎症模型中抑制TMEM16A蛋白可减少内皮细胞分泌粘附分子。本项目，我们将采用TMEM16A基因敲除鼠制备体内外缺血小鼠模型，利用分子生物学、病理学等技术研究靶向抑制TMEM16A蛋白，探讨TMEM16A在缺血性脑卒中后对血脑屏障的病理作用，以及可能的分子机制，为缺血性卒中临床治疗提供新思路和尝试。

研究目的：炎症反应是造成缺血性卒中后血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）结构和功能破坏的重要原因，引起炎症反应的关键因素是白细胞与血管内皮细胞的粘附、外渗。跨膜蛋白16A（TMEM16A）蛋白是新发现的钙离子激活Cl-通道的分子基础，在真核生物组织广泛表达，与炎症反应有关。探讨TMEM16A在缺血性脑卒中后对血脑屏障的病理作用，以及可能的分子机制，为缺血性卒中临床治疗提供新思路和尝试。.研究方法：在体内实验部分，我们对B6小鼠行一侧大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，部分小鼠尾静脉注射TMEM16A抑制剂，于再灌注后不同时间点评估小鼠脑梗死体积及神经行为学功能，同时利用注射伊文思蓝以及免疫球蛋白的荧光染色观察两组小鼠的血脑屏障破坏程度。蛋白印迹、脑片荧光染色实验检测TMEM16A以及紧密连接蛋白在模型前后的表达情况。为进一步研究TMEM16A对缺血后血脑屏障的调控作用，我们利用内皮细胞系构建体外血脑屏障模型，采用跨膜电阻（TEER）实验、荧光葡聚糖渗透以及单核细胞黏附来比较抑制TMEM16A前后血脑屏障结构和功能的改变。同时在体和体外都检测黏附分子的表达。机制方面，采用免疫印迹、核质分离检测p65核转移，通过免疫共沉淀观察p65与TMEM16A是否有直接的相互作用。.研究结果：.1.TMEM16A主要表达在脑内的血管内皮中，MCAO后TMEM16A蛋白表达显著升高；.2.TMEM16A抑制剂显著减少MCAO后的梗死体积并改善神经功能缺损；.3.靶向抑制TMEM16A能显著抑制缺血介导的血脑屏障通透性增加，并且减少中性粒细胞的浸润和黏附分子的表达；.4.靶向抑制TMEM16A能提高体外血脑屏障模型完整性，降低黏附分子表达以及单核细胞黏附；.5.靶向抑制TMEM16A通过影响NF-κB信号通路下调缺血引起的黏附分子表达。.结论：脑缺血后，靶向抑制TMEM16A能通过影响NF-κB信号通路下调ICAM-1的表达，进而减少白细胞浸润，保护血脑屏障的完整性，本研究为缺血性脑卒中临床治疗提供新的思路和理论依据。