流感病毒M2蛋白第79位氨基酸修饰影响病毒复制及致病性的分子机制

M gene plays an essential role in the pathogenicity and transmissibility of the 2009 pandemic H1N1 influenza virus infecting human, however, the exact mechanism remains unclear. Our preliminary data showed that the molecular weight of A(H1N1)2009 M2 protein is larger than those of H3N2 and classical H1N1 swine influenza viruses (about 2kDa) in Western Blotting. Further studies showed that M2-79E residue contributes to the difference of the molecular weight and affects the viral replication. We hypothesize that there might be certain post translational modification at M2-79E that affects the viral replication and pathogenesis. In this study, software analysis, mass spectrometry, protein modification inhibitor will be used to identify the modification type of M2-79E. Furthermore, to investigate the effects and molecular mechanism of M2-79E modification to viral pathogenicity, functions of M2-79E on membrane scission, viral budding, vRNP packaging, and NLRP3 activation will be evaluated, which will improve the understanding of pathogenicity of influenza viruses.

2009年暴发的甲型 H1N1流感病毒的M基因在病毒的致病性及传播性中起了重要的作用，然而具体的分子机制尚不清楚。本研究前期通过免疫印迹实验发现，A(H1N1)2009病毒的M2蛋白分子量比H3N2及古典H1N1猪流感病毒的M2大（约2kDa），进一步研究发现A(H1N1)2009病毒M2-79E位点造成M2蛋白分子量差异，并影响病毒的复制。我们推测M2-79E位点可能存在某种蛋白修饰，并影响该病毒的复制与致病性。我们拟通过软件预测、质谱分析、蛋白修饰抑制等方法确定A(H1N1)2009病毒M2蛋白79E的修饰方式，通过反向遗传系统研究这种修饰对病毒复制、致病性以及传播性的影响，并通过检测M2-79E位点对M2蛋白的细胞膜剪切功能、病毒出芽、病毒RNP的包装、NLRP3炎性反应激活等影响，解析M2-79E蛋白修饰对病毒致病特性的影响与分子机制，从而进一步了解流感病毒的致病机制。

2009年，在墨西哥和美国暴发了由一株具有高度传播性的甲型H1N1流感病毒A(H1N1)2009感染人引起的疫情。研究发现该株病毒是北美三源重排猪流感病毒H3N2与欧亚类禽猪H1N1流感病毒NA与M基因重排的产物，然而造成致病力提高和传播性提高的机理尚不清楚。.实验中我们发现A(H1N1)2009病毒M2条带与相同氨基酸数的三源重排H3N2及古典H1N1猪流感病毒的M2在Western Blot检测中相比稍高约2kDa。通过氨基酸序列比对以及定点突变，发现是A(H1N1)2009病毒M2蛋白的第79位氨基酸造成的。双标签实验证明，该种差异并不是由蛋白水解引起的。利用反向遗传技术，分别拯救得到M2蛋白第79位氨基酸为79E(WT)和79K的两种病毒，即A(H1N1)2009M2-WT和A(H1N1)2009M2-79K。在体外检测病毒的复制能力，结果显示，突变病毒复制能力明显低于野生型毒株。以小鼠为模型检测其对小鼠的致病性，突变病毒在小鼠肺内复制能力低于野生型毒株；突变组死亡率为33.3%，而野生型组为100%，说明此位点的突变对病毒的复制和致病性具有重要的作用。.M2蛋白的第79位氨基酸位于胞内区，对其机理研究结果显示，此位点突变降低了子代病毒出芽能力、造成子代病毒RNA的包装能力下降。检测M2-WT与M2-79K蛋白对细胞中NLRP3通路的激活情况，结果显示，在不同两种蛋白刺激下，ASC、NLRP3、IL-1β、Caspase-1等蛋白在细胞内的表达水平存在显著差异，野生型显著高于突变型。证明该位点可以通过影响病毒的出芽、包装、细胞内NLRP3通路从而影响病毒的毒力。.综上所述，A(H1N1)2009病毒M2蛋白的第79位氨基酸对病毒的复制和致病性至关重要，这可能是A(H1N1)2009流感病毒高致病性的原因之一。