食管癌功能基因ezrin增强子元件、激活蛋白及其信号通路

我们以往曾率先研究证明，ezrin在食管癌中显著过表达，与癌细胞增殖、侵袭迁移以及患者生存期缩短等密切相关，是食管癌重要功能基因。近年来，为了探讨食管癌中ezrin过表达调控机制，我们克隆了该基因启动子，并从启动子近端鉴定出一复合型转录调控元件，在调控其基础表达中发挥作用，详见J Biol Chem 2009,284:7995-8004；而与此同时还在启动子的中远端，发现存在着某增强子元件，活性很强，可能主要负责其诱导表达。但该元件的具体位置、类型与结构特征、激活蛋白及其信号通路等均不清楚。基于此，本项目拟通过渐进式PCR缺失截短、定点突变、报告基因、凝胶滞留与超滞留、染色质免疫共沉淀以及信号通路特异性阻断等系列实验方法，针对上述重要科学问题，展开深入系统研究，全面揭示食管癌中ezrin基因过表达调控机制，并进一步提升到系统肿瘤生物学高度，结合ezrin相关基因变化，深入挖掘其临床意义。

EZR蛋白在细胞中发挥多种功能。但调控其表达的分子机制尚不清楚。本项目把揭示EZR在食管癌中的转录调控分子作用机制作为研究目标，获得如下新发现。.EZR基因含V1和V2两个转录亚型，两者的转录起始位点不同，但编码相同的蛋白质。RT-PCR检测发现V1和V2在食管癌细胞中均有表达，但是V1高于V2； 分别用EGF、bFGF、和TPA等因子刺激，qRT-PCR检测发现EGF和TPA仅对V1表达具有明显诱导作用；而bFGF诱导的是V2； ChIP及EMSA确证EZR启动区内Sp1和AP-1结合元件是TPA应答元件；通路特异性抑制剂研究证明，TPA诱导EZR上调是通过激活MEK/ERK1/2信号通路，增强Sp1和 c-Jun与其元件结合实现的。综合上述结果，本项目在食管癌细胞中发现了TPA诱导EZR基因V1亚型表达的一种新转录调控机制。.SMYD3是一种组蛋白H3K4甲基转移酶。来自食管癌组织芯片及细胞和动物实验数据显示，EZR与SMYD3表达正相关，是SMYD3调控的直接靶基因。进一步深入的分子机制研究证明，一个长链非编码RNA EZR-AS1参与了SMYD3介导的EZR表达。在食管癌细胞系与食管癌组织中，EZR-AS1与EZR表达明显正相关；敲降EZR-AS1，伴随EZR表达的降低，食管癌细胞的移动能力也被明显减弱；在EZR-AS1敲降的食管癌细胞中，过表达EZR可使细胞的移动能力得以恢复；RIP和RNA pull down结果显示，EZR-AS1与SMYD3间存在直接相互作用，并且这种相互作用与EZR-AS1和EZR启动子区形成杂交链相关；敲降SMYD3，EZR-AS1失去调控EZR表达的功能；而敲降EZR-AS1可导致SMYD3及H3K4me3在EZR启动子区分布减少，而过表达EZR-AS1，会获得相反的结果。总之，本项目揭示了EZR-AS1与SMYD3互作促进EZR表达的新机制。.我们还首次证明NGAL蛋白与钙黏素蛋白L1CAM均可通过激活MEK/ERK信号通路，上调EZR的表达，促进食管癌细胞的侵袭转移；而Dapper家族的DACT2可通过特异性抑制TGF-beta/SMAD2/3信号通路，改变EZR的表达和定位，降低食管癌细胞的增殖、侵袭和移动。.综上所述，我们的系列研究表明，在食管癌细胞中，EZR转录既可以被多种因子诱导，也受长链非编码RNA调控。