高通量研究Sox/POU转录因子二聚体与DNA序列库的结合调控作用

Transcription factors (TFs) can identify and bind cis-regulatory DNA in a sequence specific manner. This way, they direct gene expression programs and determine cell fates. In most cases, TFs work together combinatorially and individual TFs can elicit alternative outcomes in different contexts by switching partner factors. In particular Sox/POU dimerization plays an important role in somatic cell reprogramming and the differentiation of somatic lineages including neuronal development. Our group has discovered molecular principles of Sox/POU cooperation in genome regulation and demonstrated how alternative pairs of POU and Sox factors can dimerize in a context specific manner to determine different cell fates. Previously we successfully used low and medium throughput assays including cooperativity by sequencing (Coop-seq) to study the Sox/POU partner code. We now propose to study Sox/POU pairing at unprecedented scale using 100,000s of enhancer sequences in parallel with a repurposed deep sequencing device. In addition to cooperativity factors, we will measure absolute affinities as well as the association and dissociation kinetics of TFs alone or in the presence of partner proteins. By integrating our high throughput biophysical dataset with genomic annotations and binding patterns of Sox and POU proteins during cellular reprogramming we will uncover fundamental principles how TFs ‘read’ cis-regulatory codes and how the information conferring cellular identities is hard-wired in mammalian genomes.

转录因子蛋白能够选择识别并结合基因组中的顺式DNA序列，从而调控基因表达，并决定细胞命运。多数情况下，转录因子蛋白单体能通过与其他转录因子结合形成多聚体来指导调控作用，若结合蛋白不同，调控结果则会有很大差异，但此过程分子机制尚不明确。Sox/POU转录因子二聚体，在体细胞重编程、神经分化等过程中起重要作用。本课题组长期对Sox/POU转录因子蛋白的协作机制与基因调控作用开展研究，且已在前期中利用中等结合筛选技术Coop-seq，成功获得一些Sox/POU在不同DNA特征序列上的二聚协同结合形式，并验证了其独特的基因调控效应。本课题中，我们将首创十万级别DNA序列的高通量测量技术，深入研究Sox/POU二聚体与DNA特征序列结合的选择性、协同性和动力学等一系列结合规律，并结合基因组中相关注释序列，阐明Sox/POU的生物物理学特性，及此特征在基因表达调控中的作用机制，完善该领域的研究方法。

SOX和POU转录因子家族在哺乳动物早期胚胎发育和细胞重编程过程中起着至关重要的作用。在此项目中，我们建立了一种高通量筛选具有增强功能的工程化POU转录因子（ePOU）的方法，该ePOU能够加速成纤维细胞重编程为诱导多能性干细胞（iPSC）的过程。为了探究POU因子和DNA调控元件之间相互作用的机制，我们进行了一系列高通量的生化和基因组实验。首先，我们建立了特异性测序方法（Spec-seq）并发现ePOU和Oct4的同源结合位点之间的微小差异。接下来我们采用了高通量指数富集的配体系统进化技术（HT-SELEX），并鉴定了POU因子以单体或同源二聚体结合的DNA元件。我们发现ePOU更倾向于特异性结合MORE+1回文基序，因而能促进多能性重编程。在这些新发现的DNA结合元件中，有一个具有CpG核心（CpGpal）的紧凑的回文序列可被差异性甲基化。我们发现Oct4以一种高度协同的方式与此元件的结合，但机制未知。且此元件CpG的甲基化可促进Oct4的结合。然而，与CpGpal的结合是Oct4所独有的，其他体细胞POU因子，例如Brn2，基本上不与此元件结合，并不能形成同源二聚体。因此，和此类位点的结合或许是Oct4作为能够诱导多能性的先锋转录因子而有别于其他体细胞POU因子的基础。另外，为了探究SOX和POU之间的异源结合，我们用纯化的HMG box和POU结构域进行了电泳迁移率实验（EMSA）。我们还建立了一种使用哺乳动物细胞过表达全长蛋白的新型EMSA，用以评估蛋白的N端和C端在结合中的作用。通过此技术，我们发现全长的SOX17和OCT4在一种发现于生殖细胞和原始内胚层增强子中紧凑的SoxOct DNA元件上形成具有高协同性的异源二聚体。然而，一个改造的SOX17（eSOX17FNV）和OCT4会在发现于多能性基因增强子中的经典SoxOct DNA元件上形成高协同性的异源二聚体。因此，我们得出结论，在胚胎发育和细胞重编程过程中，SOX和POU转录因子之间的选择性同源或异源二聚体结合起到了决定细胞命运的独特作用。综上，在蛋白二聚体互作表面进行选择性氨基酸位点突变能够显著改变转录因子结合DNA调控元件和表观沉默的DNA的方式，因而改变转录因子驱动细胞命运转换的能力。