CsrA调控鲍曼不动杆菌生物膜形成的分子机制研究

Biofilm formation of Acinetobacter baumannii is the major reason for its resistance and dissemination. The cell surface proteins play an important role in bacterial adhesion and biofilm formation. Recent studies showed that the carbon storage regulator (CsrA) is an RNA binding protein, which regulates mobility, virulence and biofilm formation through binding to the 5'untranslated region of the target mRNAs in various eubacteria.Our preliminary studies confirmed CsrA was present in Acinetobacter baumannii, and there was a significant negative correlation between the levels of csrA mRNA and the capacity of biofilm formation of Acinetobacter baumanni.The mechanism is unknown. and our preliminary studies showed that the mRNAs of oprD-like and dcaP-like have multiple conserved sequences of the CsrA binding sites in Acinetobacter baumannii. it is likely that CsrA negatively regulates biofilm formation of Acinetobacter baumannii by these surface proteins. Based on preliminary studies, the mRNAs of oprD-like and dcaP-like directly regulated by CsrA will be identified by Red recombination, 5'RACE, Toeprint assay and RNA gel mobility shift assay. The project will yield novel insight into the CsrA regulatory networks in biofilm information of Acinetobacter baumannii.

鲍曼不动杆菌生物膜形成是其耐药及传播的主要原因。近年的研究表明，碳储存调控因子（CsrA）通过与靶mRNAs 5'非翻译区结合，调控多种细菌的运动、毒力及生物膜形成。我们先前的研究已证实CsrA存在于鲍曼不动杆菌，且csrA mRNA表达量与该菌产生物膜的能力显著的负相关，但机制未明。我们前期的研究工作也显示：鲍曼不动杆菌编码细胞表面蛋白oprD-like和dcaP-like mRNAs上存在多个CsrA结合位点。CsrA很可能通过这些表面蛋白而负性调控鲍曼不动杆菌生物膜形成。本课题拟利用Red重组系统、5'RACE、Toeprint法、EMSA等获得CsrA调控oprD-like和dcaP-like的直接证据，从而明确CsrA在鲍曼不动杆菌生物膜形成中调控oprD-like和dcaP-like的具体机制，为确定CsrA作为抗细菌生物膜治疗新靶点及预防鲍曼不动杆菌传播提供坚实的实验依据。

绝大多数临床分离的鲍曼不动杆菌株具有较强的生物膜形成能力，当其生物膜形成后对抗菌药物的敏感性显著降低。因此，深入研究鲍曼不动杆菌生物膜形成的调控机制，筛选抑制生物膜形成或破坏成熟生物膜的药物靶点刻不容缓。. 本研究：①探讨了CsrA在鲍曼不动杆菌中的表达水平，并分析其和鲍曼不动杆菌生物膜形成能力的联系。结果提示，CsrA基因表达水平与鲍曼不动杆菌生物膜量呈负相关；②进一步分析证实，过表达CsrA可以降低鲍曼不动杆菌生物膜量，下调CsrA蛋白的功能可以提高鲍曼不动杆菌生物膜量，证实了CsrA对鲍曼不动杆菌生物膜的抑制作用；③过表达CsrA基因可以降低鲍曼不动杆菌的毒力，但是对生长速率无明显影响。外源加入CsrA蛋白可以抑制鲍曼不动杆菌的生物膜，在一定浓度内，浓度越高效果越明显，提示CsrA基因有成为抑制鲍曼不动杆菌生物膜的靶点的可能；④RIP实验证实CsrA蛋白可结合170个基因的RNA，发挥全局调控作用。转录组学分析发现过表达CsrA基因上调了35个基因RNA的转录，下调了5个基因RNA的转录。蛋白质组学分析发现过表达CsrA基因引起共437个基因蛋白水平表达改变，其中上调298个蛋白，下调139个蛋白；⑤CsrA蛋白可以与danJ基因RNA结合从而引起danJ基因表达上调，而danJ基因表达上调又可以抑制鲍曼不动杆菌生物膜的形成能力，其机制可能是通过增强两种环脂肽（putisolvin I and II）的合成，从而抑制生物膜的形成；⑥通过卡泊芬净对鲍曼不动杆菌生物膜的抑制作用研究，证实卡泊芬净对鲍曼不动杆菌生物膜具有显著抑制作用；⑦证实N-乙酰半胱氨酸对鲍曼不动杆菌生物膜的抑制作用及与替加环素的联合作用；⑧通过观察鲍曼不动杆菌持留菌的特点，提示鲍曼不动杆菌中确实可以存在典型的持留菌亚群。. 本课题的研究成果提示CsrA可作为鲍曼不动杆菌产生物膜能力的评估指标，并为确定CsrA作为抗生物膜治疗靶点及预防鲍曼不动杆菌传播提供科学依据。