多点突变AAV2载体玻璃体腔注射转导猴视网膜色素上皮细胞的研究

Safely and efficiently transferred to the target specific tissue cells is still one of the key step in the success of gene therapy for retinal diseases.The current widespread use of adeno-associated virus (AAV) vector is difficult to penetrate the inner retinal layers to reach the retinal outer layer of pigment epithelial cells by intravitreal injection, and is used to injected into subretinal space to transduction outer layer of retinal cells. Retinal detachment caused by the injection into the subretinal foveal cone cells to cause damage to central vision loss.AAV capsid protein, designated amino acid mutations can be increased greatly with its transduction activity. Our previous studies have shown that five point mutations in the AAV2 vector transfected cells of the mouse retina by intravitreal injection. In this project, we will test the hypothesis that multiple Y-F mutant capsid AAV2 vectors when delivered to the cynomolgus monkeys of vitreous can achieve retinal pigment epithalium that is similar to conventional vector delivered subretinally.Our results will provide new ideas and new methods for current gene therapy of retina diseases.

安全高效地将目的基因转入到特定的靶组织细胞中依然是目前视网膜疾病基因治疗成功与否的关键步骤之一。目前普遍使用的腺相关病毒（AAV）载体通过玻璃体腔注射后很难穿透视网膜内层到达视网膜外层色素上皮细胞，通常通过视网膜下腔注射来转导外层视网膜细胞。视网膜下腔注射造成的视网膜脱离对中心凹锥体细胞造成损害，使中心视力下降。将AAV衣壳蛋白的定点氨基酸突变可较大幅度地提高其转导活性。我们前期研究显示五点突变的AAV2载体通过玻璃体腔注射能转染小鼠视网膜全层细胞。本项目将对AAV2载体造成酪氨酸多点突变并用小鼠筛选出穿透能力较强的相应突变载体，通过食蟹猴来探索玻璃体腔注射转染视网膜尤其是黄斑部视网膜色素上皮细胞的可能性。将为目前正在进行的视网膜基因治疗提供新思路和新方法。

安全高效地将目的基因转入到特定的靶组织细胞中依然是目前视网膜疾病基因治疗成功与否的关键步骤之一。本研究通过对 AAV 载体造成多点突变并用小鼠筛选出穿透能力较强的相应突变载体，通过灵长类来探索玻璃体腔注射转染视网膜尤其是黄斑部视网膜色素上皮细胞的可能性。结果发现：1、突变的AAV2载体和多点突变的AAV8载体通过小鼠视网膜下腔注射都可以转染视网膜及RPE细胞。而玻璃体腔注射则未能有效转染视网膜细胞及RPE细胞。2、单纯进行玻璃体腔注射只能转染灵长类猴子视网膜黄斑中心凹处细胞，但相对于视网膜下腔注射，玻璃体腔注射对视网膜的损害更小。3、纤溶酶和载体同时联合应用在小鼠、新西兰兔玻璃体腔进行注射可以提高注射后对视网膜色素上皮细胞的转染效率。本研究中构建新型AAV载体，转染视网膜色素上皮细胞效率更高，同时探索发现载体玻璃体腔注射仅仅可以转染灵长类黄斑区中心凹细胞，而非灵长类动物实验中发现载体联合纤溶酶注射，可以提高玻璃体腔注射的载体转染视网膜色素上皮细胞的转染率。这对于目前临床进行的基因治疗具有重要意义。