水通道蛋白4参与心肌细胞容量调节及心肌保护机制的研究

Myocardial ischemia is generally accepted to be characterized by swelling of cardiomyocytes, resulting in collapsing of cellular structures and cell death. The mechanisms of endogenous cardioprotection against myocardial ischemic/reperfusion injury are still unclear. Alleviating swelling then keeping the integrity of cardiomyocytes may be the pivotal mechanism of cardioprotection. We give the hypothesis that aquaporin 4(AQP-4), a water selective channel localized at the membrane of cardiomyocyte, may involve in cell volume regulation and cardioprotection. In this study, we would use AQP-4 inhibitor and gene knockout mice, prepare to: 1. Induce the volume change in the isolated cardiomyocyte by osmotic concentration; 2. Detect the myocardial edema and myocardial infarction area with in-situ heart models of myocardial infarction and ischemic conditioning(pre- and post-); 3. Inhibit the classic signal transduction pathways in AQP-4 inhibitor preconditioning in-situ heart model; combining with various experimental methods, to investigate the cardiomyocyte volume change, myocardial edema, myocardial infarction, gene and protein expression of AQP-4, protein expression of the signal transduction enzymes, to explore the role of AQP-4 in cell volume regulation and cardioprotection. This study would enrich the cardioprotective theories from another viewpoint and provide new target for the treatment of ischemic/reperfusion injury.

在缺血缺氧状态下，心肌细胞水肿将引起组织结构的破坏从而导致细胞的死亡。心肌缺血/再灌注损伤的内源性心肌保护机制尚不明确。减轻心肌细胞水肿、保持细胞的完整性可能是心肌保护的关键。我们提出假设，位于心肌细胞膜的水通道蛋白4（AQP-4）可能通过细胞容量调节来参与心肌保护作用。本研究将应用AQP-4阻滞剂及其基因敲除小鼠，结合小鼠的离体心肌细胞和在体心脏模型，拟通过：1、渗透浓度诱导分离的心肌细胞的容量变化；2、在体心肌梗死和缺血处理再灌注模型（预处理和后处理）检测心肌水肿和心肌梗死面积；3、AQP-4阻滞剂预处理缺血再灌注模型结合经典信号转导通路抑制剂；应用多种实验手段，检测心肌细胞容量、心肌组织水肿和心肌梗死面积，测定AQP-4和信号转导通路酶的表达，研究AQP-4参与心肌细胞容量调节及心肌保护的机制。本课题将从新的视角丰富心肌保护理论，为缺血/再灌注损伤提供新的治疗靶点。

心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）严重影响心肌梗死再灌注治疗效果。因此，迫切需要制定有效的策略，阐明预防或减轻心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）的机制以改善患者的临床结局。缺血预处理(IPC)是一种成熟的适应性反应，心肌细胞短暂暴露于缺血/再灌注，从而提高心肌对缺血损伤的耐受性。连接蛋白 43（Cx43）已被证实与IPC有关。水通道蛋白4（AQP-4）和Cx43 形成的半通道一样，主要存在心肌细胞膜的表面，在高渗环境下对心肌细胞的容量调节中起着重要作用，其在MIRI中的作用及机制尚不明确。1.本研究以IPC期间心肌细胞的容量调节为重点，探讨Cx43在细胞膜上形成的半通道在IPC诱导的心肌保护中的作用。小鼠心肌细胞分别用半通道阻断剂、辛醇或18a-甘草酸和cx43沉默慢病毒处理。在低渗溶液中培养，模拟缺血再灌注(SIR)和缺血预处理(IP)。在加入低渗溶液30分钟后，倒置显微镜检测细胞形态和体积变化。用台盼蓝染色法测定心肌细胞死亡率。结果显示Cx43形成的半通道结构参与心肌细胞容量调节，在低渗状态下，阻断Cx43形成的半通道开放可减轻心肌细胞水肿。结论：缺血预适应可能通过阻断Cx43半通道结构的开放发挥心肌细胞保护作用。2.本研究利用小鼠心肌细胞系(HL-1)和经典的MIRI模型，探讨AQP-4在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制。在本研究中，我们利用HL-1，分别在正常(NC)、缺血(IS)和缺血再灌注(IR)条件下培养，加或不加用水通道蛋白4抑制剂(TGN-20，标记为AQP4i)。采用扫描电镜(SEM)、免疫荧光染色、流式细胞术、实时荧光定量PCR和western-blotting等方法检测细胞形态学、超微结构、细胞活力和凋亡蛋白表达模式。结果显示：IS及IR条件下，AQP4表达增高；抑制AQP4可有效减轻缺血-再灌注相关细胞活力的损害；AQP4i主要通过抑制焦亡减轻缺血再灌注：与IS+Sham组和IR+Sham组相比，IS+ AQP4i组和IR+AQP4i组细胞焦亡相关基因与蛋白表达均下调。通过免疫荧光染色进一步证实了AQP4i处理对IS和IR组HL-1细胞中GSDGM表达的抑制作用。我们的研究为靶向AQP-4介导的心肌细胞焦亡治疗心肌缺血-再灌注损伤提供了新的参考。