苹果纯合基因型种质群体的创建及小孢子诱导产生胚状体机理的研究

Apple is characterized by a high degree of heterozygosity derived from self-incompatibility,the production of doubled haploid (DH) by anther and microspore culture offers new possibilities for genetic studies and breeding. In the present study, experiment will be carried out with the cultivars ?American Summer Pearmain? ,?Senshu? and ? Danxia? and aims to obtain about 50-100 lines of homozygous plants by changing the media component and condition of culture, to study the origin and regular of embryogenesis from pollen by morphological and anatomical observations of embryos at different stages, to analysis the key gene concerned with hormone synthesis in the formation of embryos by using transcriptone sequencing and expression profiling and clone the full-length sequence of the gene, to analysis the structure of protein by using bioinformatics soft and predict the function, to verify its function via transgenic Arabidopsis Thaliana and analysis the regulation mechansim in the development of embryos form microspores. This study would provide homozygous plants for genetic studies and breeding and reveal the mechanism of embryogenesis from pollen in the level of cytology and molecular biology.

利用小孢子/花药培养诱导产生胚状体获得纯合基因型株系，对基因型高度杂合的苹果育种及遗传分析有重要意义。本研究以胚状体产生率较高的苹果品种 "祝光"、"千秋"和"丹霞"的小孢子/花药为试材，通过调整培养基成分及培养条件，诱导小孢子/花药形成胚状体并再生成植株，获得50-100株的纯合基因型群体；通过培养过程的细胞学观察，明确胚状体的起源、发生规律，以及胚状体形成的各个细胞形态学时期；利用转录组及表达谱测序、生物信息学分析的方法，筛选与胚状体形成有关的特异大量上调表达关键基因，克隆其全长cDNA，利用大肠杆菌进行体外原核表达，分离、纯化蛋白，进行蛋白的结构和功能预测与分析；通过转化拟南芥鉴定基因功能，分析基因在花粉发育、胚状体形成过程中的调控机制。研究结果将为苹果重要性状的遗传分析和杂交育种提供纯合基因型材料，并为揭示苹果雄性生殖细胞诱导形成胚状体的细胞形态学和分子生物学机理提供理论依据。

利用小孢子/花药培养诱导产生不定胚获得纯合基因型株系，对基因型高度杂合的苹果育种及遗传分析有重要意义。本研究以苹果品种 ‘嘎啦’‘丹霞’‘富士’等的花药为试材，通过调整培养基成分及培养条件，诱导小孢子形成不定胚并再生成植株，获得了135株花药培养再生植株群体，利用流式细胞仪对其中107株进行倍性分析表明，有单倍体2株，二倍体90株，三倍体6株，四倍体6株；对部分再生植株试管苗进行植物学特征调查表明，纯合二倍体长势相对于嘎啦杂合供体较弱，不同二倍体纯合植株的植物学特征也存在差异；来源鉴定采用SSR标记法，筛选出‘嘎啦’SSR标记20个，位于17个连锁群上；选出了‘富士’和‘丹霞’的部分连锁群SSR标记；利用得到的SSR标记鉴定‘富士’‘丹霞’‘嘎啦’花药培养再生的植株均为小孢子来源的纯合基因型植株。对鉴定为纯合基因型的部分植株进行了生根、形状观察、田间移植。通过培养过程的细胞学观察，明确了不定胚起源于单个的小孢子细胞，并观察到由一个小孢子细胞发育成不定胚的细胞形态学过程。利用转录组测序和生物信息学分析的方法，对差异表达基因的COG、GO及KEGG注释发现，差异基因主要集中在碳水化合物运输代谢和激素信号转导中；在低温诱导条件下淀粉合成量减少、蔗糖合成量增加；生长素含量的降低，细胞分裂素、脱落酸、油菜素内酯、赤霉素含量的增加。本研究结果为苹果重要性状的遗传分析和杂交育种提供了纯合基因型群体材料，明确了苹果小孢子细胞形成不定胚的细胞形态学过程，丰富了能源物质和几种重要植物生长调节物质调节小孢子细胞再分化机制的认识。