TGF-β-Smad-CTGF/PPARγ-c-Ski信号交联介导肝纤维化及荔枝核总黄酮的效应机制

Hepatic fibrosis is critical in the three steps of hepatitis, hepatic cirrhosis and hepatic tumor. The activation of HSC is the key link in the process of hepatic fibrosis, while TGF-β1 is the first signal related to the activation and transformation of the neighboring resting HSC. PPARγ agonist can activate PPARγ and inhibit the signal of TGF-β-Smad and the expression of CTGF and MMP-9, stopping the development of hepatic fibrosis effectively. The signal crosstalk of TGF-β-Smad- CTGF/PPARγ-c-Ski controls the development of hepatic fibrosis. TFL is effective in regulating blood lipid, resisting oxidation and protecting liver, and it has been proven by our team that TFL is functional in resisting hepatic fibrosis. Based on the signal passway crosstalk between TGF-β-Smad and PPAR-γ and the in vitro and in vivo experiments, the techniques of Western Blot and RT-PCR are adopted here to detect the expressions of TβRⅠ, TβRⅡ, p300, CBP, CTGF, c-Ski, MMP2/9 and TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ, with the purpose of discussing the regulating effect of TFL on the mentioned signal crosstalk.

肝纤维化是"肝炎－肝硬化－肝癌"三步曲中最关键的环节。而HSC激活是肝纤维化发生的中心环节，TGF-β1是启动邻近静息态HSC激活和转化的初始信号之一；PPARγ激动剂可激活PPARγ，抑制TGF-β-Smad信号及其下游CTGF和MMP-9等表达，有效地抑制肝纤维化的发生发展。在其过程中TGF-β-Smad- CTGF/PPARγ-c-Ski信号交联(cross talk)调节着肝纤维化的进程。荔枝核总黄酮(TFL)有调血脂、抗氧化和保肝作用，本课题组前期研究已证实TFL具有抗肝纤维化作用，因此，本课题从TGF-β-Smad/PPAR-γ信号通路交联角度出发，通过体内、外实验，运用Western Blot，RT-PCR等技术检测信号关键蛋白TβRⅠ、TβRⅡ、p300、CBP及下游CTGF、c-Ski、MMP2/9、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型胶原表达，探讨TFL对上述信号交联的调节效应。

目的：初步探讨TGF-β-Smad- CTGF/PPARγ-c-Ski 信号交联介导肝纤维化及TFL的干预效应。方法：通过复制SD大鼠肝纤维化模型及体外干预HSC-T6细胞，运用免疫组化法、Western Blot、ELISA、RT-PCR、透射电镜检测TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad3/4、p300/CBP、PPAR-γ、c-Ski以及下游CTGF、MMP2/9、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型胶原表达。结果：体内实验中，各实验组血清 AST，ALT 和肝纤维半定量评分、肝组织α-SMA蛋白表达均明显降低(P＜0.05)，肝组织PPARγ、c-Ski mRNA和蛋白表达的表达明显升高 (P＜0.05)，且具有一定量效关系。肝组织中PPARγ与c-Ski表达呈正相关（r=0.936，0.910，P＜0.05）,肝组织α-SMA的表达与肝纤维化程度呈正相关（r=0.886，0736，P＜0.05），肝组织PPARγ、c-Ski的表达与肝纤维化程度呈负相关（r=-0.723， -0.674， -0.583， -0.672，P＜0.05）。体外实验中，TFL 作用 48h 后160ug/ml TFL明显抑制 HSC-T6 增殖，并随着浓度的升高抑制作用加强；药物处理48h后细胞中TFL药物组均能提高细胞中PPARγ的含量，降低TGFβ，Smad4， CTGF和Smad3的含量，有统计学意义， C-ski变化不大，没有统计学意义， TFL用药组细胞成纤维化细胞比例明显降低；RT-PCR结果显示CTGF，Smad3， Smad4，TGFβ1下调，PPARy上调，有统计学意义，C-ski基本没变化；Western Blot结果显示：药物处理48h后， TFL药物组的TGFβR I， TGFβR II，III型胶原和 I型胶原表达程度均有一定程度的降低；TIMP变化不大，肝星状细胞纤维化降低；电镜结果显示：TFL组相对于空白组，肝细胞损伤有不同程度的减轻，成纤维细胞明显减少。结论：TFL能够抑制HSC-T6细胞的增殖，阻止向纤维化细胞方向发展，有效抑制肝纤维化的形成。其抑制作用可能是通过PPARy的上调和TGFβ，Smad4 ，CTGF，Smad3的下调来抑制胶原纤维的形成从而抑制肝纤维化的发生和发展。