梅花CBF/DREB1类基因的功能解析及应用研究

CBF/DREB1类基因在植物对低温的适应中起着十分重要的调控作用。梅花为我国十大名花之一，也是我国最为重要的冬季开花的落叶乔木。本项目针对当前植物CBF/DREB1类基因研究的发展趋势以及梅花的抗寒等问题，全面克隆梅花的CBF/DREB1类同源基因，并通过基因的时空表达分析及转基因研究，阐明其在低温胁迫过程中的基本功能；同时将克隆得到的CBF/DREB1类同源基因构建成基因超量表达载体，导入梅花，以调控其下游冷应答基因的表达，从而获得抗寒能力提高的梅花转基因株系。项目的实施将从理论上对梅花抗寒的分子机理进行系统的探讨，为木本植物逆境胁迫的分子机制增添新的证据，同时通过对低温信号传导关键基因的表达调控，可望获得抗寒能力提高的转化植株，丰富在"三北"地区露地栽培的梅花种质资源。

以‘雪梅’gDNA和低温驯化RNA反转录的cDNA为模板，克隆了7个CBFs同源基因，分别命名为PmCBFa、b、c、d、e、f、g，对应的cDNA和gDNA序列比较表明这7个基因均无内含子，且编码氨基酸具有AP2结构域及两翼信号序列。利用半定量和实时定量RT-PCR以及低温和ABA处理下的表达谱数据，分析了PmCBFs同源基因的表达模式，结果表明：PmCBFs同源基因受低温、干旱胁迫和机械扰动的诱导而表达，但低温胁迫下的表达丰度高于其他胁迫；低温胁迫下，PmCBFa表达量高于其他6个同源基因，1h时开始诱导表达，8h或12h表达量达到第一次高峰，48h时达到第二次高峰，而PmCBFb、c 4h时开始诱导表达，48h时表达量达到高峰。转化烟草植株的低温胁迫分析显示：PmCBFa、b、c同源基因能增强转基因植株清除ROS的能力，从而提高其抗寒性。分别建立了‘雪梅’成熟胚子叶、胚轴和未成熟胚不定芽、体胚再生体系，优化了以成熟胚子叶、胚轴和未成熟胚为受体的遗传转化体系，获得了转PmCBFa、b、c同源基因的梅花植株，低温胁迫分析初步表明其抗寒性增强。克隆了分属不同品种群6个梅花品种的PmCBFa、b、c同源基因，比较了其在编码氨基酸上的保守性，分析了其在ABA、低温、渗透胁迫下的表达水平变化；转不同梅花品种PmCBFa、b、c同源基因的部分拟南芥植株，表现出矮化、叶色变绿、叶片变小且呈莲座状以及种子生活力下降等形态特征变化，同时转化植株T2代幼苗的耐冻害能力增加。