糖原合成酶激酶3β/缺氧诱导因子2α在肝脏缺血再灌注损伤中的作用机制

Hepatic ischemia/reperfusion injury (IRI) has been one of the major problems in liver transplantation, especially donation after cardiac death. Infiltration of Kupffer cell and release of inflammatory mediator are well-known explanations for hepatic IRI. It has been established that inhibition of glycogen synthase kinase (GSK)-3β, namely phosphorylated GSK-3β ameliorates hepatic IRI via regulation of immune function. Our previous studies indicated that activation of hypoxia inducible factor (HIF) - 2α significantly reduced IRI, considering the important role of HIF-2α in inflammatory reaction. Based on that lots of in vivo and ex vivo studies showed inhibition of GSK-3β induced HIF-2α expression, we speculate that inhibition of GSK-3β may prevent hepatic IRI through a HIF-2α-dependent way. To prove this theory, we plan to selectively knockout HIF-2α in different types of cells in liver, and then subject the liver to IR procedures, to show the effect of GSK-3β inhibition on hepatic IRI in mice with different gene background. Furthermore, we plan to detect the levels of p-GSK-3β and HIF-2α in liver grafts from cardiac death and analyze these data with prognostic condition of recipients, to conclude how GSK-3β/HIF-2α signaling affects liver transplantation recipients from donation after cardiac death. This study may help promote understanding of GSK-3β/HIF-2α in the prevention of hepatic IRI, which may serve as a novel therapeutic strategy.

肝脏缺血再灌注损伤（IRI）是肝移植尤其心脏死亡（DCD）供肝移植的重要临床问题，枯否细胞浸润及炎性介质释放是公认的主要机制。研究显示抑制糖原合成酶激酶（GSK）-3β，即磷酸化的GSK-3β通过调节免疫功能可以明显减轻肝脏IRI。我们的前期研究提示缺氧诱导因子（HIF）-2α的激活能显著改善IRI，且HIF-2α在炎症反应中起到重要作用。基于诸多体内、外实验提示GSK-3β的失活能明显上调HIF-2α的表达，我们推测GSK-3β失活通过诱导HIF-2α的表达实现对肝脏IRI的保护。我们拟采用不同细胞类型HIF-2α敲除小鼠，观察抑制GSK-3β活性情况下各敲除小鼠的肝脏IRI程度，并探明该影响的分子特异性和细胞类型特异性。然后进一步检测临床DCD供肝组织中磷酸化GSK-3β、HIF-2α的表达，结合临床指标分析两者对DCD供肝移植受者预后的影响，为改善DCD供肝IRI提供新的干预靶点。

抑制糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）被证明能保护肝脏缺血再灌注损伤（IRI），但其保护肝脏IRI的具体机制尚未阐明。我们通过GSK-3β的抑制剂（SB216763/CHIR99021）在小鼠肝脏IR模型上进行验证，明确了抑制GSK-3β对肝脏IRI的保护作用，IR后的血清学指标如谷丙转氨酶、谷草转氨酶，病理学HE染色所示的肝细胞损伤及炎症细胞浸润，细胞凋亡指标如TUNEL、Caspase3活性等均有显著改善；同时PCR及免疫组化显示肝组织内的炎症因子亦有明显缓解。另外，我们发现SB216763/CHIR99021作用于小鼠肝脏IRI模型后，肝组织内自噬相关蛋白LC3B、ATG-5的表达明显增加，提示抑制GSK-3β是通过激活组织自噬反应从而发挥保护肝脏IRI的功能。因此我们在此模型的基础上增加了自噬抑制剂3-MA的干预，发现3-MA消除了SB216763/CHIR99021对肝脏IRI的保护作用。为了探明抑制GSK-3β如何调控自噬反应，我们通过Western-Blot发现抑制GSK-3β明显提高了激活自噬的关键位点AMPK的磷酸化水平。因此，我们提出假设抑制GSK-3β通过AMPK通路激活自噬，从而发挥保护肝脏IRI的作用。为此我们在肝细胞损伤及炎症细胞浸润，细胞凋亡指标如TUNEL、Caspase3活性等均有显著改善；同时PCR及免疫组化显示肝组织内的炎症因子亦有明显缓解。另外，我们发现SB216763/CHIR99021作用于小鼠肝脏IRI模型的基础上使用了AMPK抑制剂，结果发现抑制AMPK通路，抵消了抑制GSK-3β对肝脏IRI的保护，亦减轻了肝组织的自噬反应。以上研究结果，我们通过肝细胞的缺氧/复氧的体外实验，再次验证了同样的结果。综上所述，我们的研究结果表明抑制GSK-3β通过激活AMPK通路，进而激活自噬反应，最终保护肝脏缺血再灌注损伤。这对于GSK-3β、AMPK通路及自噬相关靶点的干预药物在临床上对肝脏移植、肝脏切除等手术患者的缺血再灌注损伤改善，将提供详细的理论和基础实验数据，从而进一步推动这些靶向药物在临床上的应用，最终改善肝病患者的预后。