化学感受蛋白（chemosensory proteins,CSPs）在家蚕化学识别及发育过程中的功能研究

Bombyx mori is an important economic insect and the model organism of Lepidoptera. It's very important to clarify the mechanism of gene regulation in chemical recognition and development. The functional mechanism of chemosensory proteins(CSPs) in B. mori chemoreception and development were studied in this project. The preliminary work showed obvious differences of csp genes expression in B. mori larval development, which indicated that these CSPs might invovle in the regulation of larval development. In this project, the expression profiling of all the B. mori CSPs in different development stages and different tissues were analysed on both mRNA level and protein level by real-time PCR, Northern blot and Western blot, from which the csp genes related to chemoreception and development were selected; after expression, the mechanism of CSPs involved in chemorecognition were elucidated from their biochemical characteristics, three dimensional structure, physiological function; at the same time, the mechanism of CSPs involved in B. mori metamorphosis development were studied from their phenotype by RNA interference and overexpression. Further researches on B. mori CSPs, will not only to clarify the molecular mechanism of CSPs involved in chemical recognition and development, provide the theoretical basis for the cultivation of high yield and quility of new varieties of transgenic silkworm, but also provide new strategies for lepidoptera agricultural pests.

家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物，阐明其化学识别和发育过程的基因表达调控机制具有重要意义。本项目以家蚕为对象，研究化学感受蛋白（chemosensory proteins,CSPs）在其化学感受中的识别机制及发育过程中的调控作用。前期工作发现，部分家蚕csp基因在幼虫发育中的表达存在明显差异，提示它们可能参与幼虫的发育调控。该研究拟从mRNA和蛋白水平上分析所有csp基因及其蛋白在家蚕不同发育阶段、不同组织的表达谱；筛选出参与化学识别或调控生长发育的基因；表达蛋白，从其生化特性、三维结构、生理功能阐明其参与化学识别的作用机理；同时通过干涉和过表达csp基因，从表型上研究其参与家蚕变态发育的调控机制。对家蚕CSPs的功能研究，不仅能够对CSPs参与家蚕化学识别、生长发育的分子机制有较清晰的诠释，为培育高产优质转基因家蚕新品种提供可借鉴的理论依据，而且为鳞翅目农业害虫防治提供新的控制策略。

本项目以家蚕为研究对象，对家蚕中16个编码CSPs的基因进行了克隆、表达和功能研究。家蚕不同CSPs之间的序列差异性暗示它们可能具有不同的功能。8种CSPs蛋白被成功表达和纯化，并制备了多克隆抗体。利用qRT-PCR和Western杂交对16个CSPs在不同发育时期和不同组织的表达情况进行分析，结果显示，家蚕CSPs广泛存在于卵、幼虫、蛹和成虫中。家蚕CSPs在时间和空间上表达的广泛性与其在化学识别中的特异性是不一致的，由此表明家蚕CSPs不仅在昆虫化学感受中发挥作用，也可能在其他非化学感受的过程中发挥作用。荧光结合实验发现，家蚕CSP1和CSP2对一系列化合物具有不同的结合特性，表明了其在化学识别中具有结合小分子化合物的载体作用；而CSP16与65种配体化合物的结合较弱，置换探针的比例都低于50%，推测CSP16可能具有除化学识别外的其他功能。对CSP9在家蚕幼虫不同时期表达和定位的深入研究表明，CSP9在幼虫不同时期的表达量呈现规律性变化；免疫荧光定位结果显示，CSP9广泛分布于不同龄期幼虫的体表感受器，表明该蛋白可能在家蚕幼虫中发挥重要作用。此外，我们发现了一个家蚕miRNA的预测靶基因是CSP。利用双荧光素酶报告系统在细胞水平上分析miRNA与CSP 3’-UTR的互作，结果表明，二者共转后报告基因酶活性与对照相比下降2倍以上，而报告基因在mRNA水平上的表达无明显变化，由此表明该miRNA可以通过与靶基因3’-UTR的互作在翻译水平上调节靶基因的表达。miRNA在家蚕个体中的表达分析表明，miRNA主要分布于家蚕雌雄成虫的化学感受器官，与交配前相比，交配后触角和头部miRNA的表达量都有大幅上升，其中雌蛾触角最为明显，推测其可能通过调控靶基因CSP的表达在家蚕成虫交配过程中发挥作用。通过在家蚕触角注射miRNA激动剂和抑制剂可以很好的达到过表达或抑制miRNA的效果，注射前后CSP在mRNA水平上的表达量无明显变化，表明miRNA并非在转录水平上对靶基因进行调控。该结果为进一步阐明miRNA可以作为新的调控因子参与家蚕的嗅觉识别奠定了基础。