LysKP2和LysKP1在噬菌体JD001侵袭及裂解肺炎克雷伯菌中的作用与机制

With the epidemic of multidrug resistant and pan-drug-resistant Klebsiella pneumoniae or other such bacteria worldwide, clinicians worry "no antibiotics available" in the future, bacteriophage and its endolysin has been re-valued in anti-infective therapy in post-antibiotic era. Our previous study identified a Myoviridae phage JD001 that can kill K. pneumoniae effectively, preliminary tests showed its endolysin LysKP1 and LysKP2 could destroy the structure of K. pneumoniae. We speculate that LysKP2 may be a component of the tail of phage JD001 according its genomic structure and participate in the invasion of K. pneumoniae; while LysKP1 can lysis bacteria and may be involved in the process of release after maturation. In this study, in order to reveal the mechanism and function of LysKP2 and LysKP1, the crystal structure LysKP2 and LysKP1 will be analyzed; whether LysKP2 is the components of phage JD001 or not and its distribution in the structure of phage JD001 will be confirmed; the antibody will be used to block active sites of LysKP2 to illuminate its impact on invasion of K. pneumoniae by phage JD001; at the same time, the enzymatic activity of LysKP1 and its substrates’ chemical bonds will be determined; furthermore, their active sites will be clarified and verified by obtaining different mutants. The implementation of this project will reveal the mechanism of bactericidal activity of phage JD001 at protein level, it can also provide the foundation of the development of derivative products of LysKP2 and LysKP1 for the prevention and control K. pneumoniae.

多重耐药和泛耐药肺炎克雷伯菌（简称肺克）等的流行让临床治疗陷入“无抗生素可用”的境地，噬菌体及其裂解酶在“后抗生素时代”抗感染治疗重受重视。课题组前期鉴定的肌尾科噬菌体JD001能够杀死肺克，初步研究证实其裂解酶LysKP2和LysKP1能破坏细菌结构。根据基因组结构推测，LysKP2可能是噬菌体尾部结构组成部分，在噬菌体侵袭肺克中发挥作用；LysKP1可能参与噬菌体成熟后裂解细菌并释放的过程。本课题将解析LysKP2和LysKP1的晶体结构；1确认LysKP2是否是噬菌体JD001的组成部分，及其定位；制备抗体封闭LysKP2作用位点了解其对侵袭肺克的影响；2分析LysKP1酶活和作用底物化学键；3阐明LysKP2和LysKP1的活性位点，并通过基因突变手段加以验证；阐明LysKP2和LysKP1的功能。为揭示噬菌体JD001的杀菌分子机制和开发裂解酶类抗菌制剂用于防控肺克感染奠定基础。

细菌耐药性日益严峻，人类已经进入“后抗生素时代”，即已有抗菌药物不在对引起感染的病原起作用。噬菌体作为能杀灭细菌的病毒，在其发现之后就被尝试用于细菌感染的防控。然而随着抗生素的发现及规模化工业生产和广泛应用，噬菌体的抗菌治疗不再受重视。近年来，随着细菌耐药性的日益严峻，尤其是高毒力泛耐药的肺炎克雷伯菌在临床上危害巨大，噬菌体抗菌治疗重新备受重视，课题组发现了一株新的肺炎克雷伯菌噬菌体JD001。通过透射电镜观察其形态，属于肌尾科噬菌体，就其生物特性研究发现，其具有较好的酸碱稳定性，对宿主菌的吸附效力强，生长周期约60min。于此同时，通过解析其全基因组序列发现，其基因组上不携带有可能的有害基因（比如：耐药基因和毒力基因）。这意味着用于其抗感染治疗过程中，其不会成为这些有害基因的载体，在不同细菌之间传播这些有害的基因，在基因组水平具有良好的安全性，而且可将该噬菌体纳入治疗用噬菌体库中的一员。同时，我们通过生物信息学方法预测了可能在噬菌体侵染和裂解宿主菌过程中起关键作用的酶类LysKP2和LysKP1。进一步实验研究发现，LysKP2具有类溶菌酶活性，其能破坏细菌外围结构，而且Mg2+和Cu2+能增强其酶活。LysKP1在E.coli BL21中表达后，能对细菌有杀灭作用，能破坏细菌外围结构。此外，我们也在小鼠皮肤感染模型中验证了噬菌体在预防和治疗皮肤脓肿细菌感染的有效性，并且在食品模型中验证了噬菌体可以作为食品防腐剂；而且建立了基于基因组学对噬菌体安全性评估体系。最后我们建立了噬菌体抗菌治疗的安全性评估体系。本研究项目及其研究成果为深入了解噬菌体的杀菌机制以及为噬菌体尽快进入临床进行抗菌治疗奠定了基础。在本项目的支持下，本研究在《Virology Journal》 和《微生物学报》等杂志上发表论文6篇。