基于氨基酸-mTORC1信号通路的青蛤耐盐机制研究

Cyclina sinensis is an important marine fishery and aquaculture clam which belongs to euryhaline species. The special molecular mechanism of osmoregulation is not yet clear in C. sinensis. It has been reported that mTORC1 signaling pathway is involved in osmotic stress response in mammals and aquatic animals. Based on the preliminary study of comparative transcriptome, this project will study the roles of mTORC1 signaling pathway regulated by amino acid in salinity tolerance in C. sinensis. In this project, we intend to identify the key genes mTOR involved in the mTORC1 signaling pathway by gene cloning and functional analysis, analysis the proteins interacting with mTOR by Yeast two-hybrid and GST pull-down techniques to analyze the physiological function and mechanism of mTOR protein, and detect the amino acids that regulate the mTORC1 signaling pathway through amino acid excess/deficiency tests. This study will reveal the salinity tolerance mechanism of C. sinensis based on amino acid-mTORC1 signaling pathway, enrich the contents of molecular mechanism of osmoregulation in euryhaline shellfish, and provide a scientific basis for water quality management in C. sinensis farming.

青蛤（Cyclina sinensis）是我国重要的海水养殖品种，属典型广盐性贝类，其特殊的渗透压调节分子机制尚不十分明确。已有报道显示，mTORC1信号通路在哺乳动物和水产动物中都可参与渗透压胁迫响应。本项目将基于已构建的青蛤盐度胁迫转录组数据库，研究氨基酸介导的mTORC1信号通路在青蛤盐度耐受中的作用。对mTORC1复合体中的催化核心mTOR蛋白进行基因克隆及功能分析，验证其在青蛤盐度耐受中的作用；采用酵母双杂交和GST pull-down技术鉴定与mTOR互作的蛋白，解析mTOR蛋白的生理功能及作用机制；通过氨基酸过量/缺乏实验，明确调控mTORC1信号通路的氨基酸。研究成果有助于揭示青蛤基于氨基酸-mTORC1信号通路的耐盐机制，丰富广盐性贝类渗透压调节机制的研究内容，也为青蛤健康养殖水质管理提供科学依据。

青蛤（Cyclina sinensis）是我国重要的海水养殖品种，属典型广盐性贝类，探究其特殊的渗透压调节分子机制可以为青蛤的健康养殖水质管理提供科学依据。本研究主要围绕氨基酸-mTORC1信号通路在青蛤耐盐胁迫中的作用机制展开研究。通过盐度胁迫7d青蛤肝胰腺转录组有参数据库和蛋白质有参数据库的分析，分别获得了青蛤肝胰腺中参与青蛤盐度耐受的候选基因283个，候选蛋白265个。克隆获得了青蛤mTOR基因5559bp的开放阅读框（ORF），预测编码1852个氨基酸，分子量为211.75kD，含有 Rapamycin bind、PI3Kc、FATC等结构域。表达量分析结果显示，该基因在青蛤鳃中表达量最高，而且在受到盐度胁迫后会出现显著的下调，直至盐度胁迫后7d仍未恢复到初始水平。渗透压检测结果显示，低盐胁迫后青蛤血淋巴的渗透压逐渐降低，在胁迫后48h达到最低，之后渗透压有所回升，但仍低于初始水平。高盐胁迫后，青蛤血淋巴的渗透压呈逐渐上升趋势，在高盐胁迫后72h达到最高值。项目采用高效液相色谱法检测了盐度胁迫7d后青蛤肌肉组织中的17种游离氨基酸，发现这些氨基酸在低盐、对照、高盐组别中均呈现显著差异（P<0.05）。此外，我们还确认内参基因组合EF1-α-GAPDH-RPS18适用于盐胁迫下的qRT-PCR分析，证实青蛤对低盐胁迫的耐受性强于高盐胁迫。通过低盐胁迫24h青蛤鳃转录组的构建和分析，进一步确认mTOR信号通路参与了青蛤的耐盐胁迫，而且有可能是通过激活下游ATG1基因促进细胞自噬来响应盐度胁迫。研究成果初步揭示了青蛤基于氨基酸-mTORC1信号通路的耐盐机制，丰富了广盐性贝类渗透压调节机制的研究内容，也将为青蛤健康养殖水质管理提供科学依据。