基于焦磷酸测序的农药多残留生物条形码免疫分析方法研究

Immunoassay was one of the most important monitoring methods for the detection of pesticide residue. However, the lack of multiplexed rapid testing products for the detection of peisticide residues made the site supervision for the quality of plant-origined agro-products to the embarrassed situation. To solve the bottleneck, the bio-bar code immunoassay for the multiplexed detection of pesticide residue based on pyrosequencing was prepared to be carried out. Four bio-bar codes with the function of signal amplification were designed and synthesized, subsequently the corresponding colloidal gold nanoparticle probes to the four pesticides (triazophos, parathion, methyl parathion and chlorpyrifos) were developed by the combinations of the single bio-bar code and the colloidal gold nanoparticle coupling with the single monoclonal antibody against pesticides. The four magnetic nanoparticle probes to four pesticides were developed by the combination of magnetic nanoparticles and single conjugate (ovalbumin coupled with single pesticide hapten). Based on the sequences of the bio-bar codes, the pyrosequencing primers were designed and synthesized. On the basis of development of nanoparticle probes and the primers for pyrosequencing, the bio-bar code immunoassay based on pyrosequencing for the multiplexed detection of the four pesticides was developed. The work will broaden the research scope for the bio-bar code immunoassay, enrich the basic theory of immunoassay for the multiplexed detection of pesiticide residue and is positive to improve the level of China's food safety.

免疫分析方法是农药残留检测的重要技术手段，然而稳定准确的农药多残留快速检测产品的缺失致使我国果蔬等农产品的现场监管面临较为尴尬的境地。为解决这一现实瓶颈，本项目拟开展基于焦磷酸测序的农药多残留生物条形码免疫分析方法研究。设计并合成4条具有信号放大作用的生物条形码，将单一农药抗体和对应的生物条形码修饰于胶体金颗粒上，分别制备得三唑磷、对硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱等4种农药对应的胶体金纳米探针；筛选并活化磁性纳米粒子，与单一反应原（半抗原及OVA偶联物）结合，制备得4种农药对应的磁性纳米探针；根据生物条形码碱基序列，设计并合成焦磷酸测序所需引物。在纳米探针和测序引物制备基础上，建立基于焦磷酸测序的农药多残留生物条形码免疫分析方法，实现对上述4种农药的快速准确同步检测。这可拓展生物条形码免疫分析的研究范围，丰富农药多残留免疫分析方法的基本理论，有利于保障我国食品安全。

农药残留超标问题是影响果蔬等食用农产品品质及安全的重要问题，免疫分析方法作为快速检测的经典方法，对于实现食品中农药残留的快速定性定量，具有重要学术意义。生物条形码免疫分析方法是近年来免疫分析领域研究的热点，已在蛋白、核酸检测等大分子物质的检测方面实现了很好的应用。在上一个国家自然科学基金项目（31201371）资助下，本团队率先基于竞争反应模式，将短链DNA片段与免疫分析方法相结合，实现了生物条形码免疫分析方法对小分子化合物的单残留检测。.为了实现对多种农药残留的同时检测，设计合成了对硫磷标记用单链生物条形码DNA、生物条形码的互补链、生物素标记的生物条形码，并制备了胶体金纳米探针与磁性纳米探针，构建了基于焦磷酸的生物条形码DNA定量体系，并合成制备了纳米酶Au@Pt复合物，研发了基于纳米酶的对硫磷生物条形码免疫分析体系，检测限为2.13 ng/kg，在此基础上，合成了对硫磷、甲基对硫磷、三唑磷与毒死蜱四种农药对应的单链生物条形码DNA，及生物条形码的互补链、生物素标记的生物条形码，制备了4种农药相应的胶体金纳米探针与磁性纳米探针，构建了可实现对甲基对硫磷、对硫磷、三唑磷与毒死蜱4种农药多残留检测的生物条形码免疫分析体系, 检测限分别为136.4 ng/kg、9.88 ng/kg、3.91 ng/kg、1.47 ng/kg。.在本项目资助下，发表论文9篇，其中SCI论文8篇，均为一区论文；申请国家发明专利1项；作为“农产品中典型化学污染物精准识别与检测关键技术”成果之一获2019年国家技术发明奖二等奖，项目主持人金茂俊为获奖第3完成人。本项目构建的生物条形码免疫分析方法，可实现对不同农药的多残留检测，区别于现有报道的多残留免疫反应模式，是对多残留免疫分析方法学的重要创新，拓展了分析方法的基础理论，具有重要的科学意义。同时建立的分析方法灵敏度高，可从农药残留拓展到其他小分子化合物的同时检测，在食品安全、环境监测及医学检验领域具有良好的应用前景。