RNAi和Groel介导的双价抗番茄黄化曲叶病毒的研究

针对侵染我国烟草和番茄等植物的双生病毒番茄黄化曲叶病毒（TYLCV），利用重叠PCR分别扩增复制酶基因、病毒抑制子基因和外壳蛋白基因的两两融合片段，构建3个不同类型的RNAi植物表达载体。农杆菌介导法转化烟草和番茄，分析比较不同RNAi载体构建类型下转基因植物的抗病毒效果。根据RNAi和Groel基因抗性机制的不同，培育同时含有RNAi和Groel的双价转基因烟草和番茄，研究其对TYLCV和其它双生病毒的抗性提高效果。探讨利用RNAi和Groel协同增效作用建立高效抗病体系以及培育植物双价抗病毒株的可能性。本项目提出了RNAi和Groel共同介导的广谱性和持久性抗双生病毒分子遗传育种策略，为进一步开展RNAi和Groel共同介导的植物抗病性机制研究奠定理论和技术基础。

本项目针对目前番茄黄化曲叶病毒病危害严重，并且抗源匮乏，抗性不稳定的现状，利用遗传转化方法以创制抗性更好的抗性材料为目的，培育同时含有RNAi和Groel的双价转基因烟草和番茄，研究其对TYLCV和其它双生病毒的抗性提高效果。同时，还尝试开展了烟草抗番茄黄化曲叶病毒的体细胞无性系突变体的离体筛选的工作。最后对抗性作用机制进行了分析。研究工作主要包括通过农杆菌介导的遗传转化法共转化烟草和番茄，获得同时含有SUC2-GroEL（利用拟南芥韧皮部启动子SUC2和烟粉虱内共生菌GroEL基因构建）和pBI121-AC1-AC2反向重复序列植物表达载体（利用TYLCV的AC1和AC2基因构建）的再生植株19株。对T0代双价和单价转基因植株进行农杆菌注射接病和烟粉虱传毒检测，发现接种1个月后，SUC2-GroEL转基因植株的病毒数较对照下降了45-56%，pBI121-AC1-AC2转基因植株的病毒数较对照下降了54-78%，而双价转基因植株则下降了81%-100%。而从表型上看，双价转基因植株同样表现出更好的抗性效果。对T1代转基因植株进行农杆菌注射接病和烟粉虱传毒检测，双价转基因植株同样较单价转基因植株表现出更好的抗性。通过本研究，确定了转双基因植株的抗病能力强于转单基因植株的抗病能力。另外，为了获得烟草抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)突变体材料，以含有番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆PTYj01的农杆菌EHA105侵染转化烟草叶片，将表型正常的再生植株移栽，温室接种烟粉虱传毒鉴定再生烟草在整个生育期对TYLCV的抗性，共获得8株表型正常、无TYLCV病症的烟草。对这8个抗性植株T2代烟草通过农杆菌注射法和接种烟粉虱鉴定，发现T2-3、T2-7的T2代分离群体中有约75%的植株没有发病症状，说明T2-3、T2-7可能发生了抗TYLCV突变。说明通过对侵染性克隆转化的烟草进行体细胞离体筛选，获得抗TYLCV突变体的方法是可行的，为培育抗病毒材料提供了一种新方法。对照合同，本项目已经完成相关的研究内容，并进行了一定的拓展，完成相关指标。