LncRNA-IRAR上调趋化因子促进肾脏缺血再灌注损伤的作用及机制研究

Immune inflammation is the main pathophysiological mechanism of renal ischemia-reperfusion injury (IRI). It has been demonstrated that long noncoding RNA (LncRNA) is a critical regulator of immune inflammation and participates in the cerebral and myocardial IRI process. It is a potential intervention target for IRI, but its role in renal IRI is unknown. By microarray technique, we previously screened the LncRNA IRAR that may be associated with the renal IRI in mice, and in vivo knockdown of IRAR significantly alleviated renal IRI. Gene co-expression analysis and in vitro test showed that IRAR up-regulated the expression of chemokines CCL2 and CXCL1/2. Therefore, we hypothesized that hypoxia induce high expression of IRAR in renal tubular epithelial cells, which up-regulates CCL2 and CXCL1/2 expression, recruiting immune cells, initiating immune inflammation and promoting acute kidney injury (AKI). Here, we will study the role of IRAR and its regulatory chemokines in the pathogenesis of IRI by bioinformatics, gene overexpression and silencing, and conditional gene knockout on renal tubular epithelial cells, and further elucidate the molecular mechanisms of IRAR transcriptional regulation and IRAR regulation of chemokines as well. This project will reveal the pathogenesis of renal IRI from LncRNA- chemokine-immune inflammation pathway, and provide a new target and method for the treatment of ischemic AKI.

免疫炎症反应是肾脏缺血再灌注损伤(IRI)主要病理生理机制。已证实LncRNA是免疫炎症的重要调节子，参与心脑IRI过程，是干预IRI的潜在靶点，但在肾脏IRI中的作用不明。我们前期利用高通量基因芯片筛选出与肾脏IRI可能相关的LncRNA IRAR，体内敲减IRAR可明显减轻小鼠肾脏IRI；基因共表达分析及体外验证实验发现IRAR正向调控趋化因子CCL2、CXCL1/2表达。因此提出假设：缺血缺氧诱导肾小管上皮细胞高表达IRAR，通过上调CCL2、CXCL1/2趋化免疫细胞、启动免疫炎症、促进急性肾损伤发生。本项目拟利用肾小管条件性基因敲除等手段，探讨IRAR及其调控的趋化因子在肾脏IRI发生中的作用，并进一步阐明IRAR转录调控、IRAR调控下游趋化因子的分子机制。本项目将从LncRNA-趋化因子-免疫炎症这一新视角揭示肾脏IRI发病机制，为缺血性急性肾损伤的防治提供新靶点和新思路。

免疫炎症反应是肾脏缺血再灌注损伤（IRI）发生、发展的主要病理生理机制。免疫细胞的趋化和组织浸润是启动免疫炎症的关键。越来越多的证据表明，长链非编码RNA（LncRNAs）在免疫炎症调控中发挥重要的作用，是免疫系统基因表达的关键调节子，调节免疫细胞的分化和功能。项目组利用高通量芯片检测了小鼠肾脏缺血再灌注24h后的肾组织LncRNA和mRNA表达谱，并通过生物信息学分析和初步的体内外验证实验，筛选出与肾脏缺血再灌注损伤可能相关的LncRNA-IRAR（NR_003548）及其调控的目标基因趋化因子CCL2和CXCL1/2。通过免疫荧光原位杂交实验（FISH）明确IRAR表达在肾小管上皮细胞，主要定位于胞质。体内敲减IRAR表达，可明显减轻小鼠肾脏缺血再灌注诱发的炎症反应：包括炎症因子和趋化因子表达、炎细胞（包括中性粒细胞、巨噬细胞）浸润，减轻急性肾损伤。体外沉默和体外过表达实验证实：IRAR调节肾小管上皮细胞趋化因子CCL2和CXCL1/2。进一步采用CXCL1/2受体(CXCR2)抑制剂干预小鼠肾脏缺血IRI模型发现，CXCR2抑制剂可明显减少IRI引起的肾脏中性粒细胞募集，抑制炎症反应。构建肾小管CCL2条件性敲除小鼠（包括近端小管上皮细胞条件性CCL2敲除小鼠和远端小管上皮细胞条件性CCL2敲除小鼠），分别建立小鼠肾脏IRI模型，发现近端小管上皮细胞条件性CCL2敲除可显著减轻IRI引起的炎细胞浸润、炎症因子表达和急性肾损伤。最后证实，肾脏缺血再灌注过程中，转录因子C/EBP β调节IRAR表达，IRAR是C/EBP β下游靶基因。. 本研究从分子、细胞和动物等层面深入探讨IRAR及其调控的趋化因子在肾脏缺血再灌注后启动免疫炎症、促进急性肾损伤中的作用，阐明IRAR调控趋化因子表达、炎症反应和急性肾损伤的分子机制。从LncRNA-趋化因子-免疫炎症这一新视角揭示缺血性AKI的发病机制，为以LncRNA-IRAR/趋化因子信号通路为靶点，干预缺血性AKI提供理论依据，从而为AKI的防治提供新的思路和手段。