番茄DNA去甲基化酶SlDML2调控途径相关因子的筛选及功能分析

DNA methylation is an important epigenetic mark involved in many biological processes. Recently, it was demonstrated that RNA interfere or knock out SlDML2 in the tomato, the ortholog of DNA demethylase AtROS1 strongly inhibits the onset and progression of ripening. The promoter of about 1200 differentially expressed genes were hypermethylated in sldml2 mutant, which normally demethylated during fruit ripening in WT. This suggests that SlDML2 is improtant for the global loss of DNA methylation. Therefore, factors drive SlDML2 to identify the targeting sites is an intriguing question. To address this question, Immunoprecipitation-Mass Spectrometry (IP-MS) in vivo and yeast two hybrid assay will be perforemed. Based on the preliminary results, 1-2 proteins interacted with SlDML2 will be funtional analyzed via combinding CRISPR techonology, whole genome bisufilt sequencing and other molecular experiments. Understanding the mechanism of DNA demethylation in fruit ripening and searching the genes associated with SlDML2 will give an insight for other fruit tree. This study will be the first case to identify new factors associated with active DNA demethylation involved in tomato fruit ripening.

DNA甲基化是一种包含在多种生物过程中的重要的表观遗传标记。在番茄中用RNA干涉或敲除拟南芥去甲基酶AtROS1的同源基因SlDML2均具有果实不能正常成熟的表型。研究发现，在果实成熟过程中，有1200个差异表达基因的启动子本该去甲基但在sldml2突变体中保持高度甲基化，这表明SlDML2在介导成熟过程中所必需的启动子DNA低甲基化中发挥规模性的功能，而精准调控如此大规模的基因甲基化，必定有除SlDML2外其他因子的参与。因此通过体内免疫沉淀-质谱法结合酵母双杂交筛库筛选出3-5个与SlDML2互作的蛋白，利用CRISPR编辑技术、全基因组甲基化测序等方法对SlDML2调控、影响果实成熟途径相关的因子进行功能分析研究。挖掘到1-2个在SlDML2调控果实成熟途径相关的因子将会是果实成熟中新的表观遗传因子，这对理解番茄果实成熟及DNA甲基化在其他肉质果实的作用提供更广泛的思路。

DNA甲基化是一种包含在多种生物过程中的重要的表观遗传标记。在番茄中用基因编辑技术敲除拟南芥去甲基酶AtROS1的同源基因SlDML2均表现出果实推迟成熟的表型。研究发现，在番茄果实成熟过程中，一部分在番茄果实成熟中本该发生去甲基化并且表达上调的基因在sldml2突变体中表达未及时上调，启动子保持高度甲基化，而本该发生去甲基化并且表达下调的基因在在sldml2突变体中表达未及时下调，启动子也保持高度甲基化。这表明SlDML2在介导果实成熟过程中所必需的启动子DNA低甲基化中发挥规模性的功能，而如何调控了这些基因的甲基化，推测有其他蛋白协同SlDML2参与这一过程。因此本项目旨在筛选出与SlDML2互作的蛋白，并探索其如何协同SlDML2发挥功能。通过酵母双杂交和免疫共沉淀技术，我们筛选到2个与SlDML2互作的蛋白LH8和D2，利用CRISPR编辑技术我们获得了LH8和D2的突变体及转基因的标签植株。通过表型观察发现LH8具有果实成熟表型。LH8不但和SlDML2互作，还能和果实成熟的关键转录因子RIN互作，三者的Chip-seq实验表明，LH8, RIN, SlDML2 共有562个共同的结合位点。因此推测其和RIN可共同介导SlDML2结合到特定基因上。另一个可以和SlDML2互作的D2蛋白同时可以和番茄中mCG识别蛋白MBD5结合，只是其未表现出果实成熟表型，因此推测D2可能协同MBD5参与SlDML2响应其他信号途径，如激素或生物胁迫等。该研究为理解番茄果实成熟及DNA甲基化在肉质果实的作用机制提供了探索基础，同时为其他肉质果实如柑橘，草莓等提供更广泛的思路。