试纸酶联免疫中特异性识别界面研究

Paper-based ELISA has shown a great potential in the self-diagnostics of patients and the improvement of medical conditions in poor areas. How to realize the accurate and sensitive detection in blood has become an important issue for the application of paper-based ELISA. The construction of specific recognition interfaces to regulate and control the nonspecific adsorption and specific binding is one of the most effective strategies. In this project, we will choose cellulose as the three-dimensional backbone, employ the host-guest interaction of cucurbit[8] to construct the antifouling hydrogel with active sites in situ. The nonspecific adsorption will be reduced based on the great amount of bound water in hydrogel; The loading capacity of antibodies will be increased by virtue of the three dimensional structure; Relying on the two effects, the analytical performance of paper-based ELISA in blood will be greatly improved. In this project, the effects of the guest content, i.e., the crosslink structure and the chemical composition on the antifouling properties, the loading capacity and specific binding kinetics, will be studied comprehensively; In addition, the analytical performance of antifouling hydrogel in blood will be systematically investigated from which we hope to establish the relationship among the antifouling property-specific recognition-analytical performance. Furthermore, the equilibrium relationship between antifouling property and specific recognition will be obtained and the mechanism of the proposed hydrogel for the immunoassay in blood will be comprehensively elucidated, thus providing an experimental and theoretical guide for the other immunoassay.

试纸酶联免疫在实现疾病的早期发现及长期跟踪方面展现出巨大的发展前景。如何实现对血液样本的准确、灵敏分析是试纸酶联免疫应用中的关键问题。构建特异性识别界面,协调表面非特异性吸附以及特异性结合作用是最有效途径之一。基于此，本项目拟提出以纤维素三维网络结构为支撑骨架，利用葫芦脲[8]主客体相互作用，原位制备带有活性位点的抗污凝胶。凭借凝胶中大量结合水，抑制表面非特异性吸附；利用三维网络结构增加抗体负载量，通过上述两方面作用，提高试纸酶联免疫对血液样本的检测效果。本项目拟着重研究凝胶中客体分子含量，即交联结构密度与组成对抗非特异性吸附、抗体负载量以及特异性结合的影响；考察抗污凝胶在血液中的检测效果，建立抗非特异性吸附-特异性结合-检测效果之间关联，获得非特异性吸附与特异性抗体固定之间最佳平衡关系，阐明凝胶表面对血液样本的免疫识别作用机制，为血液样本的免疫检测提供方法和理论指导。

试纸等便携式免疫技术在实现患者的自我监测、危重病的抢救以及改善贫困地区居民医疗条件方面展现出巨大的发展前景。然而，这些免疫分析技术均面临着难以对复杂样本，尤其血液的直接分析。为此，本项目拟通过制备抗污凝胶涂层并考察凝胶的组成结构对识别探针的负载、抗污性能以及最终复杂样本的检测效果之间的关系来协同解决上述问题。研究过程中，我们首先获得了一种利用葫芦脲[8]主客体包结络合作用，在纤维素表面构建抗污凝胶的方法。该方法简单、温和、无需催化剂且没有副反应，所构筑的凝胶涂层不仅具有显著的抗污效果而且不影响本体纤维形貌。凭借这些优点，所获得的改性纤维素试纸展现出一定的应用价值。随后我们实现了活性位点在凝胶涂层中的均匀分布，并通过改变活性位点数量实现了抗体负载的相应调节。在研究抗体负载量对检测效果的影响中发现，即使结合位点分布密度不高，仍能保证对微量抗原的捕获。例如，对目标癌症标志物-胃动素的识别研究发现，低比例活性位点的凝胶仍能对10 pg/mL的目标物进行灵敏响应。这主要是由于凝胶的三维分布自身会带来大量的结合空间，即使活性位点分布密度不高，仍能保证对微量抗原的捕获。此外，我们通过对比研究方法，着重考察了所构建的抗污凝胶涂层对于不同样本中目标物的识别效果。对比检测结果发现，相比缓冲溶液中的目标物-胃动素的识别，在5%的山羊血清浓度中，检测曲线线性相关度以及检测限均没有明显的变化；而在10%的山羊血清中检测时，由于表面非特异性吸附增强，检测响应范围缩小，检测曲线线性相关度也降低，检测结果的准确性灵敏性均开始降低。分析这一系列不同浓度的复杂样本的检测结果，同时结合对应样品的抗污结果，我们初步发现，检测样本在凝胶界面上吸附前后电流信号变化低于5%时，可能更易兼顾灵敏性与准确性。这些结果为我们接下来的凝胶设计提供了进一步可量化的研究目标，也为获得目标凝胶特异性识别界面提供了十分具有指导意义的理论基础。