FXR-胆汁酸介导的吡嗪酰胺肝毒性新机制及临床意义

Pyrazinamide (PZA) is an indispensable first-line drug used for the treatment of tuberculosis which may cause serious hepatotoxicity. Therefore, severe hepatotoxic side effects have limited PZA therapy for tuberculosis in clinic. However, the exact toxic mechanism underlying these toxicities remains unknown. Our research suggested that patients with PZA induced liver injury associated with rearrangement of bile acid. We hypothesized that FXR-bile acid mediate the hepatotoxicity of PZA. This project utilized targeted metabolomics to observe the changes of endogenous bile acids in cells, animals, and patients when generated DILI. Regulation of metabolism enzymes and transporter continued being studied. Then the mechanism underlies the hepatotoxicity of pyrazinamide mediated by FXR-bile acid was revealed using gene regulation and chemical intervention, such as knockout mice or overexpressed technology. Finally, the regulated network was built between DILI and bile acid, evaluated the potential prediction ability of DILI based on bile acid in baseline plasma. The project can not only provide a new molecular mechanism of DILI, but also provide evidence for the clinical application of PZA and new ideas for prevention of drug-induced liver injury.

一线抗结核药吡嗪酰胺（PZA）因药源性肝损伤（DILI）限制了其临床应用。目前DILI机制研究多局限于药物及其代谢产物自身细胞毒作用，但确切机制尚不明确。本项目组前期研究结果提示患者使用PZA所致肝损伤与胆汁酸代谢重排有关，提出FXR-胆汁酸代谢网络与PZA肝毒性之间调控的假说，本课题拟首先通过靶向代谢组学观察细胞、动物及患者不同水平发生DILI时内源性胆汁酸谱的变化规律；再在细胞、小鼠模型中研究PZA对FXR-代谢酶-转运体的表达调控，进一步通过基因敲除小鼠、过表达及沉默等基因调控技术及化学干预的方法揭示FXR-胆汁酸通路调控PZA所致DILI发生的分子机制；最终建立DILI的信号通路与胆汁酸互动调控的网络关系，通过胆汁酸的早期变化预测患者中PZA发生DILI的可能性。本项目不仅可阐释PZA发生DILI新的分子机制，同时为临床安全应用PZA提供新的依据，为预防DILI的研究提供新思路。

通过研究小鼠给抗结核药物引起肝毒性的胆汁酸谱变化，探讨FXR-胆汁酸介导的抗结核药物肝毒性的可能机制，为临床合理使用抗结核药物及预防肝损伤提供依据。建立小鼠血清中19种胆汁酸浓度的LC-MS/MS检测方法，对小鼠血清中的胆汁酸谱进行测定；野生型小鼠（C57BL/6小鼠）随机分成5组（每组6只）：空白对照组（0.5% CMC-Na）、Rifampin组（RIF，120 mg•kg-1）、Isoniazid组（INH，60 mg•kg-1）、Pyrazinamide组（PZA，300mg•kg-1）、HRZ组（120mg•kg-1RIF+60mg•kg-1INH+300mg•kg-1PZA），收集小鼠血清及肝组织；并采用FXR敲除小鼠（FXR-/-）以及奥贝胆酸（Obeticholic acid，OCA）干预措施，观察C57BL/6、FXR-/-小鼠（每组6只）给予HRZ、HRZ+OCA后代谢物及组织损伤变化；小鼠血清检测ALT、AST、TBIL、DBIL及TBA，观察肝功能变化；取小鼠肝脏进行HE染色，观察肝组织状态变化；通过RT-qPCR检测小鼠肝组织FXR、SHP、CYP7A1基因表达水平，western blot检测小鼠肝组织FXR蛋白表达水平。本课题建立了小鼠血清中19种胆汁酸浓度的LC-MS/MS检测方法，选取的高浓度胆汁酸4~4000ng•mL-1低浓度胆汁酸0.4~400ng•mL-1的线性范围良好，批内批间精密度RSD值均小于15%，给药后，肝组织切片显示各个给药组均有不同程度的肝损伤；ALT和AST及TBA在INH、RIF及HRZ组均显著升高（P<0.05），而PZA组升高相对较缓，其中RIF组胆汁酸升高最明显（P<0.01）。8种胆汁酸有显著变化，其中CA在给药组中均显著升高（P<0.05），野生型小鼠及临床患者在给予抗结核药物联合治疗后，CA浓度与ALT及AST有一定的相关性；临床患者的结果也表明，给以后CA的水平与抗结核药物的肝毒性有关。FXR-/-小鼠显示给药后ALT及AST较野生型升高减缓，胆汁酸升高幅度也变小；野生型小鼠显示给药后FXR、SHP表达受到抑制，CYP7A1升高，提示了抗结核药物是通过了FXR介导产生了肝毒性。