肺动脉高压候选基因KLF2的鉴定及其调节肺血管内皮-间质转化的研究

In the previous study we developed a new specific gene panel for pulmonary arterial hypertension (PAH) including major disease causing genes and further candidates. We detected a novel missense mutation in the Krüppel-like factor 2 (KLF2) likely leading to a disruption of gene function. This project aims to confirm the functional analysis of the novel mutation in the KLF2 gene, and further analyze whether KLF2 regulates the pulmonary vascular remodeling via endothelial–mesenchymal transition (EndoMT). First, we confirm whether the new mutation in KLF2 leads to functional changes by in vitro analyses of human blood outgrowth endothelial cells extracted from PAH patients. The expression of KLF2 will be investigated by animal models and human blood outgrowth endothelial cells of PAH. Subsequently, we analyze the EndoMT by over- or down-regulating the expression of KLF2 using the lentiviral vectors in vitro and in vivo. Finally, we investigate the methylation in the promoter region of KLF2 and histone modifications to determine the role of epigenetic factors in the upstream regulation of the KLF2 gene in PAH.

申请人前期的研究通过设计开发肺动脉高压特异基因芯片对肺动脉高压患者进行了基因诊断筛查，首次在一个遗传性肺动脉高压家系中发现候选基因KLF2新突变。本项目旨在此研究基础上明确候选基因KLF2突变能否导致其功能缺失，并探讨KLF2是否通过调控肺动脉内皮细胞内皮-间质转化，从而调节肺动脉高压血管重塑的新途径。首先，提取并培养肺动脉高压患者外周血内皮祖细胞明确KLF2突变体是否导致其表达下调；建立野百合碱诱导和低氧-Su5416诱导的两种肺动脉高压大鼠模型，检测动物模型及患者外周血内皮祖细胞KLF2的表达水平，在此基础上，通过慢病毒在体内和体外实验上调及下调KLF2的表达，探讨KLF2在肺动脉高压肺动脉内皮-间质转化中的作用；最后，通过体内和体外实验探讨KLF2的表达是否受基因启动子区甲基化及组蛋白去乙酰化水平的影响。

肺动脉高压是恶性的罕见心肺血管疾病，前期的研究通过设计开发肺动脉高压特异基因芯片对肺动脉高压患者进行了基因诊断筛查，首次在遗传性肺动脉高压家系中发现候选基因KLF2新突变。目的：本项目旨在此研究基础上明确KLF2在肺动脉高压中的表达水平，并探讨KLF2是否通过调控肺动脉内皮细胞内皮-间质转化，从而调节肺动脉高压血管重塑的新途径。方法：首先，在人肺动脉内皮细胞系中明确KLF2突变体是否导致其表达下调；建立野百合碱诱导和低氧-Su5416诱导的两种肺动脉高压大鼠模型，检测动物模型KLF2的表达水平以及内皮间质转化的，在此基础上，通过慢病毒在体内和体外实验上调及下调KLF2的表达，探讨KLF2在肺动脉高压肺动脉内皮-间质转化中的作用；最后，通过转录组测序筛查差异基因进一步明确下游的信号通路。结果：免疫组化染色分析显示KLF2在肺动脉高压大鼠模型中的表达水平下调；大鼠模型和人肺动脉内皮细胞中进一步验证了PAH疾病过程中存在内皮间质转化VE-cadherin表达下降，α-SMA、Fibronectin和vimentin表达升高。KLF2过表达腺病毒干预肺动脉内皮细胞以及KLF2-AAV病毒干预大鼠模型后检测内皮间质转化水平下降，且KLF2-AAV干预后大鼠模型的肺动脉压力血流动力学参数下降以及血管重塑较模型组改善。通过RNA-SEQ筛选差异基因显示KLF2通过下游GPC1信号通路发挥调节内皮功能的作用。结论：KLF2通过介导GPC1信号通路调节肺血管的内皮间质转化，调控肺动脉高压的肺血管重塑过程。