骨整合微尺度力学机制的单细胞水平研究

Osseointegration is the key to success of dental implant, mechanical mechanism is the important factor affecting the process of osseointegration.The project intends to explore the mechanisms of Microscale mechanics in the process of Implant osseointegration in the single cell level,useing the nano-scale high-resolution characterization of imaging means combined with molecular biology techniques. The project intends to use atomic force microscopy and fluorescence confocal microscope imaging system as a platform..（1）Using atomic force microscopy (AFM) cantilever with a package of laminin microspheres,to exert pressure and tension to cells micro of bone marrow stromal cell quantitatively.Using real-time observation of the fluorescent fusion protein molecules incident within bone marrow stromal cells under stress, to establish the dynamic research system of Mechanical response by the single cell level characterized by micro-area precise mechanical stimulation..（2）Integrated three-dimensional micro-manipulation techniques，combined with single-cell nucleic acid extraction technology to reveal the molecular conduction mechanism of cellular early mechanics,Clear about the relationship between stess and osseointegration。On this basis, to present the idea that microscale mechanics is the key factor for the interface microenvironment of dental implant osseointegration ,to provide mechanical parameters of the early-load for the clinical treatment and to expand the treatment to accelerate the osseointegration of implants.

骨整合是植入物成败的关键，力学机制是影响骨整合进程的重要因素。本项目拟运用纳米尺度高分辨表征成像手段与分子生物学技术结合，在单细胞水平上探究种植体骨整合进程中的微尺度力学相关机制。拟以原子力显微镜和荧光共聚焦显微镜联合成像系统为平台。（1）利用带有包被粘连蛋白微球的原子力显微镜微悬臂，对骨髓基质干细胞细胞微区定量施加压力与拉力，实时观察应力作用下骨髓基质干细胞内荧光融合蛋白分子事件，建立以微区精确力学刺激为特点的单细胞水平力学响应动态研究体系；（2）集成三维微操纵技术，结合单细胞核酸提取技术揭示细胞早期力学响应分子传导机制；（3）利用表面微模式化技术，实现细胞可控制化培养，初步探索细胞间的力学信号通讯机制，明确应力与骨整合的关系。在此基础上，提出微尺度力学是种植牙骨整合界面微环境的关键因素，为临床治疗提供早期负载的力学参数，拓展加快种植体骨整合的治疗手段。

人牙周膜细胞牙周组织重要组成部分，能对不同外力作用的产生不同生理应答，引起牙周组织细胞外基质的合成或降解。因此，研究 hPDLC 如何感受外界应力刺激，并把物理刺激转化为生物化学信号，继而引起牙周组织改建这一力学信号传导过程，对于阐明牙周组织改建的分子和细胞生物学机制意义重大。力学信号在细胞内的转导过程 分为 4 个阶段，其中有机械刺激的阶段——力学偶联阶段，为力学信号转导机制中最为关键的阶段。hPDLC如何感受不同外界应力的性质、大小、频率、作用方式，通过哪些途径接受应力信号并转化为生物化学信号，这些问题一直以来是研究的热点。.在本研究中，采用胶原酶消化结合组织块法培养原代细胞hPDLC，为细胞力学实验准备实验细胞；利用AFM研究在生理和固定状态下，以AFM/共聚焦显微镜联合成像系统，建立细胞水平力学响应动态研究体系，利用力曲线阵列法研究hPDLC的杨氏模量并计算hPDLC的应力-应变关系；在单细胞水平研究在静载荷力学刺激下hPDLC内钙离子浓度（[Ca2+]i）的动态变化规律；在单细胞水平研究在不同静载荷力学刺激hPDLC内一氧化氮浓度的变化规律。.实验研究结果表明：（1）本文以AFM共聚焦显微镜联合成像系统为平台，利用微球修饰无针尖的AFM微悬臂作为细胞微区定量施力工具，建立了以微区精确力学刺激为特点的单细胞水平力学响应动态研究体系（2）应用AFM研究在生理和固定状态下，hPDLC的表面形貌以及胞内应力纤维的高分辨成像，明确hPDLC内应力纤维分布特点；（3）应用AFM力曲线阵列计算了hPDLC的杨氏模量，研究发现hPDLC受到静载荷的机械刺激后细胞内Ca2+光密度值迅速提高，3-5秒内提高约10%，并在15秒左右回落到正常范围内，细胞内Ca2+光密度值增加与力学刺激大小关系不密切；（4）研究发现hPDLC受到静载荷的机械刺激后10-15min细胞内NO浓度逐渐增加到达顶峰，并有一定的力值依赖性，0.5nN与2.5nN之间有显著性差异；这种NO的升高在一定程度上可以被eNOS抑制剂抑制；（5）机械刺激单个hPDLC产生的NO可以将机械刺激信号向周边未接受机械刺激的hPDLC进行传递；（6）hPDLC细胞内钙离子和NO参与不同静载荷机械应力刺激hPDLC的力学信号转导，其中NO增加量可能有一定的力值依赖性；获得了hPDLC细胞间传递机械刺激信息过程中NO变化图。