颗粒酶M促进5-FU诱导的细胞自噬介导结肠癌化疗耐药的作用和机制研究

The chemoresistance has become a critical obstacle for the treatment of colon carcinoma. Based on reference studies, not only does autophagy involve in preventing the malignant transformation but also promotes the survival and functions of cells in non-ideal environment, and thus, mediating drug resistance. In our previous work, we found that granzyme M (GZMM) expression was much higher in drug-resistant colon cancer cells. Furthermore, the drug resistance and invasive abilities of various cancer cells were enhanced by GZMM. Moreover, the result showed that GZMM promoted the protective autophagy induced by 5-fluorouracil (5-FU) in colon cancer cells, which functioned in the fusion stage of autophagosome and lysosome. Accordingly, the present study is intended to employ autophagic colon cancer cells induced by 5-FU and confirm functions of GZMM involved in the autophagy and subcellular localization by confocal microscopy and transmission electron microscopy. The alternative proteins which may interact with GZMM in autophagy and interaction domain will be elucidated via constructing corresponding mutant. We will also analyze the relationship between GZMM expression and autophagy, chemoresistance or prognosis in mice model and clinical samples, exploring the value of GZMM in predicting the prognosis of chemotherapy and its prospect in the treatment of autophagy. The study will provide theoretical and experimental basis for overcoming chemoresiatance of colon cancer.

结肠癌化疗耐药已经成为临床治疗面临的重要挑战。自噬不仅作为细胞内的维稳机制阻止恶性转化，还协助肿瘤在非最适条件下保障细胞的功能促进存活从而介导耐药。申请人前期发现颗粒酶M(GZMM)在耐药的结肠癌细胞中异常高表达，并报道了其促进化疗耐药和肿瘤侵袭功能等作用。进一步研究发现GZMM能促进5-FU诱导的结肠癌细胞保护性自噬，其作用于自噬体和溶酶体的融合阶段。鉴于此，本项目拟在5-FU诱导自噬的结肠癌细胞中采共聚焦显微镜、透射电镜等方法分析GZMM对自噬的影响和亚细胞定位，构建相应蛋白突变体利用IP、Co-IP和GST-pull down等方法鉴定与GZMM的相互作用蛋白及作用位点，同时在动物和临床样本中分析GZMM的表达与自噬相关分子和化疗耐受及临床预后的联系，探索GZMM在化疗预后判断中的价值及其在以自噬为靶点的治疗中的应用前景，为克服结肠癌化疗耐受开辟新的思路提供理论和实验基础。

结肠癌化疗耐药已经成为临床治疗面临的重要挑战。自噬不仅作为细胞内的维稳机制阻止细胞的恶性转化，还协助肿瘤在非最适条件下保障细胞的功能促进存活从而介导耐药。研究发现肿瘤中多种异常蛋白酶的表达，这些蛋白酶类参与了基质重塑、肿瘤转移、血管生成、上皮间质转化和肿瘤自噬等多种过程。本项目发现颗粒酶M（GZMM）在耐药的结肠癌细胞中异常高表达，而且GZMM能促进5-FU诱导的结肠癌细胞保护性自噬，通过构建敲降和过表达细胞系以及应用自噬不同阶段的抑制剂发现GZMM其作用于自噬晚期自噬体和溶酶体的融合阶段促进自噬流。我们还发现Ras相关蛋白19（RAB7L1，小GTP酶家族成员）与GZMM共定位，敲降GZMM后通过5-FU处理RAB7L1的表达也下降了，二者的共定位减少，这提示GZMM与RAB7L1在5-FU处理后的自噬过程中发挥作用。我们在临床样本中发现RAB7L1基因和蛋白在多种肿瘤中异常高表达，而且与大量的自噬相关基因呈正相关表达，这提示了RAB7L1深度参与了肿瘤细胞的自噬过程。另外RAB7L1高表达在多种肿瘤患者中与较短的总生存期相关，但与无病生存期无显著相关，这提示RAB7L1表达可能对于肿瘤治疗后的反应抵抗，如肿瘤化疗或放疗耐药等具有显著作用从而导致总生存期缩短。我们还构建了动物模型结果显示化疗与GZMM敲降以及自噬早期抑制剂的联合应用能显著抑制肿瘤进展延长小鼠的生存期。总之，我们的结果证实了GZMM以及RAB7L1在化疗诱导的肿瘤细胞自噬发挥重要的作用促进了肿瘤细胞耐药，但是由于GZMM在淋巴细胞中表达可能限制其在自噬为靶点的治疗中的应用，而RAB7L1可能具有更好的前景，我们的研究为克服结肠癌化疗耐受开辟新的思路提供理论和实验基础。