茶树嘌呤生物碱分解代谢关键基因功能验证及其调控机制研究

Tea cultivar with low caffeine accumulation trait is the basic assurance for efficiently and securely producing low caffeine tea and tea products, however, tea plant resource with such trait is quite limited. Regulation mechanism on purine alkaloids (PAs) catabolism is unavailable until now, which is one of the most important obstacles for improvement in innovation of novel tea plant resource with low PAs. In this study, the key genes associated with PAs catabolism pathway will be screened out from tea plant leaves with different maturity based on transcriptome sequencing and differently expressed genes analysis, and the biological function of the genes will then be verified through prokaryotic and eukaryotic expression systems. To elucidate the regulating mechanism on the key genes in PAs catabolism pathway, the effect of the physiological and environmental factors on expression of the target genes will be analyzed, and the relationship among promoter characteristics, expression patterns and code domain single-nucleotide-polymorphisms of the target genes with the PAs accumulation in different cultivars will also be studied. The obtained achievements will supply a new approach for innovation of tea plant resource through transgenic tech, and will also help to develop the new PAs degradation technology with high efficiency.

低咖啡因茶树品种是实现低咖啡因茶和茶产品高效、安全生产的根本保证，但目前低咖啡因茶树资源严重不足，咖啡因等嘌呤生物碱（PAs）分解代谢调控机制不明是造成低PAs积累茶树资源创新进展缓慢的重要原因之一。本项目拟通过对不同成熟度叶片转录组测序和差异基因分析基础上，获得茶树PAs分解代谢途径相关候选基因，利用原核和真核表达系统验证PAs分解相关关键候选基因生物学功能，分析生理和环境因子对相关目的基因表达活性的影响，研究目的基因启动子特性、表达活性、编码区单核苷酸多态性与不同茶树品种PAs积累关系，明确茶树PAs分解代谢关键基因的调控机制。为低PAs积累转基因茶树新资源培育开辟新途径，也可为茶树PAs高效降解新技术的开发奠定基础。

低咖啡因茶树品种是实现低咖啡因茶和茶产品高效、安全生产的根本保证。咖啡因合成和降解途径的消长决定了其在茶叶中的含量，目前茶叶咖啡因合成途径涉及的主要酶类和基因都已明晰，但降解途径关键基因及调控机制尚不明确，该瓶颈已成为开展低咖啡因茶树资源创新与评价最重要的限制因素之一。本研究在茶、苦茶和茶×苦茶杂种不同成熟度叶片转录组和嘌呤生物碱代谢物分析的基础上，结合WGCNA关联研究，获得了茶资源咖啡因降解关键候选基因CYP82D47l.2；序列分析显示，该基因开放阅读框长1560bp，编码519个氨基酸残基、分子量~58.5kD、具2个跨膜区的细胞色素P450蛋白，且苦茶与茶×苦茶杂种之间氨基酸序列相似性为99.6%，显著高于茶与苦茶、茶与茶×苦茶杂种之间的相似性；通过原生质体瞬时表达、外源基因异源表达以及反义寡核苷酸注射技术，探明了CYP82D47l.2定位于内质网、参与咖啡因到苦茶碱的催化过程；经嘌呤生物碱代谢途径相关基因表达与代谢物含量关联分析，明确了茶、苦茶和茶×苦茶杂种嘌呤生物碱积累模式差异主要受CYP82D47l.2基因等表达水平调控，而做青等逆境条件下茶叶嘌呤生物碱含量变化影响因素较复杂；经克隆和比对，明晰了茶、苦茶和茶×苦茶杂种CYP82D47l.2基因启动子序列及顺式作用元件，并初步揭示不同茶资源中该基因的差异表达可能与启动子中-925th~-818th和-361st~-301st处的SNPs有关。研究成果为全面揭示CYP82D47l.2催化机理以及在不同茶资源嘌呤生物碱积累中的调控作用奠定了重要基础，同时也为利用该基因进行茶资源评价、种质创新技术开发和低咖啡因品种选育创造了良好条件。因此，本项目研究意义显著，应用前景广阔。