供体细胞端粒酶活性时序性变化与体细胞核重编程互作机制的研究

Eggs have the natural ability to reprogram sperm nuclei with 100% efficiency; however, it shows incomplete reprogramming of the somatic nuclei in the cloning process. It is worth emphasizing that telomerase activity of somatic cell is hardly detectable, that of germ cells yet exists on the temporal variation.Based on this, previous research made a good model in vitro, named as hTERT-bMGEs, which telomerase activity of its was identical to those of germ cells.Therefore, hTERT-bMEGs used as donor cells for nuclear transfer(NT), the main text is as following: ① It will be investigated that whether eggs can improve the efficiency of reprogram or even thoroughly reprogram somatic cell into pluripotent cells, when telomerase activity of donor cells are identical to those of germ cells. ② Based on this, epigenetic reprogramming will be further detected in somatic cell nuclear transfer. ③ Using bioinformatics and gene chips, the difference of gene expression profile will be analyzed in cloned embryo to confirm whether gene expression is identical to those of germ cells. In a word, this study is to demonstratethe interaction mechanisms between nuclear reprogramming and temporal variation of telomerase activity in somatic cell, and it will have a novel viewpoint to demonstrate the mechanization of the nuclear reprogramming.

卵子具有100%效率重编程已经定向分化的精子细胞核，但不能完全重编程体细胞核。作为供核细胞，二者的显著区别是：体细胞没有端粒酶活性，精子细胞的端粒酶活性存在时序性变化。基于此，本项目前期制备了一个牛乳腺细胞体外研究模型，命名hTERT-bMGEs，它可以模拟精子细胞成熟过程端粒酶活性的变化。拟以hTERT-bMGEs为供核细胞，主要研究如下：①查明当供核细胞端粒酶活性发生类似精子细胞成熟过程的变化时，卵子是否能提高体细胞重编程效率，甚至完全重编程体细胞；②在此基础上，进一步确认核重编程过程的表观修饰变化是否与正常受精胚一致；③更进一步地，利用生物信息学和高通量测序相结合的方法，深入分析核重编程过程的基因表达模式是否与正常受精胚一致。本研究最终目的是阐明供体细胞端粒酶时序性变化与体细胞核重编程的互作机制，为体细胞重编程的理论及应用研究提供一种新思路。

为研究供核细胞端粒酶活性发生类似精子细胞成熟过程的变化时，卵子能否提高体细胞重编程效率及可能的分子机制。课题组经过四年理论研究与技术攻关，制备了牛乳腺细胞体外研究模型hTERT-bMGEs，筛选出端粒酶活性类似精子细胞最适hTERT-bMGEsn的n 为13-17代作为候选供体细胞，统计分析体细胞克隆胚的发育情况，得出如下重要发现：证实了当供体细胞端粒酶活性和端粒长度发生类似精子细胞成熟过程的变化（hTERT-bMGEs）时，其克隆胚的卵裂率、囊胚发育率及孵化率与体外受精胚发育水平接近，且显著高于未经端粒酶修饰供核细胞组（bMGEs），证实了卵子能显著提高端粒酶修饰后的体细胞重编程效率；进一步发现端粒酶在调控体细胞核重编程过程表观遗传修饰和基因表达模式的重要变化规律：即hTERT-bMGEsn组获得克隆胚的H19、IGF2和XIST的表达量均显著低于bMGEs组，但是与4-细胞期的体外受精胚相比，hTERT-bMGEsn组获得克隆胚的H19、IGF2和XIST的表达量水平基本一致；经高通量测序表明：供体细胞经端粒酶修饰会引起250个基因上调，740个基因表达下调。Go富集分析显示差异基因主要与细胞、组织、器官及个体发育进程有关，初步证实端粒酶修饰的供体细胞可能在细胞重编程过程发挥有利的调控作用。在克隆胚转录组测序中发现：hTERT-bMGEsn组与体外受精胚相比差别表达基因并不显著，仅60个基因上调，75个基因下调；但是与bMGEs组为供体细胞获得克隆胚相比，差异基因极限著，其中有377个基因上调，988个基因下调。Go富集分析显示显著差异基因主要参与胚胎发育进程。综合表明，端粒酶修饰后的供核细胞在体细胞核重编程过程的基因表达模式与正常受精胚基本一致，且能激活与发育进程相关的许多基因，从而促进细胞的重编程，初步揭示端粒酶与体细胞核重编程的互作机制。本研究为体细胞重编程的理论及应用研究提供一种新思路，为解决体细胞克隆技术提供理论与技术支撑。