小鼠胚胎诱导型HSP70基因表达调控机理的研究

采用超数排卵、输卵管冲胚和胚胎体外培养的方法提供试验用小鼠胚胎，将发育到4细胞至囊胚前期的胚胎施不同温度的热休克处理，同时分别用KN-93、A23187、EGTA和W-7等处理胚胎，用激光共聚焦、qRT-PCR和凝胶阻滞等方法检测处理后胚胎内Ca2+浓度、CaMKⅡ和CREB的活性、HSP70和CaM mRNA表达及其蛋白含量；用RNA干扰法分别抑制CaM和HSP70基因表达，用免疫沉淀等方法检测HSF-HSE、HSF-HSP70和CaM-HSP70复合物含量，用免疫组化法检测胚胎细胞质和/或核内HSF三聚体荧光颗粒，以阐明Ca2+-CaM/Ca2+-CaM KⅡ信号转导通路及HSF分别对HSP70合成的调控作用，以及HSP70的自身反馈调节作用。研究成果不仅可以揭示小鼠胚胎诱导型HSP70合成的调控机理，还可以阐明夏季热应激和某些使体温升高的热性疾病导致哺乳动物妊娠早期胚胎死亡的机制。

项目以体外培养的小鼠胚胎、乳腺上皮细胞和睾丸支持细胞为研究对象，通过热应激诱导胚胎HSP70表达、添加激动剂和抑制剂以及RNAi方法，采用现代生物学技术和方法，检测CaM、CaMKⅡ、HSF1和HSP70在胚胎中表达变化。项目最终阐明了小鼠胚胎受热应激时，激活Ca2+- CaM-CaMKⅡ信号通路，促进HSF1磷酸化和转录活性，从而调控HSP70表达，而热应激时增多的CaM与HSP70竞争性结合，解离出HSF1，形成三聚体、入核，并增加其转录活性，从而调控HSP70表达。此外，项目还研究了黄芩苷的安胎、抗凋亡和抗炎机制，明确了其促进体外培养小鼠胚胎发育的机制是促进胚胎发育相关基因的表达，下调HSP70表达、抑制胚胎细胞凋亡、提高体外培养胚胎的质量；此外研究还发现，黄芩苷还能提高热应激下睾丸支持细胞的存活率及SCF和GDNF的表达量，通过调节Fas/FasL凋亡通路，提高睾丸支持细胞的抗凋亡能力，并通过降低乳腺上皮细胞IκB和p65磷酸化、抑制LPS诱导的NF-κB活化，减少炎性因子TNF-α和IL-1β的产生，提高其抗炎性损伤能力。在项目执行过程发表研究论文19篇，获得授权专利3项，中培养了7名研究生。